Серологические методы лабораторной диагностики сифилиса. Серологические методы исследования в диагностике паразитарных заболеваний Кровь на рск что показывает анализ

Диагностика является важнейшим этапом в лечении любого заболевания. В зависимости от правильно поставленного диагноза находится не только успешное лечение, но и возможность предотвратить развитие осложнений и сопутствующих патологий. Серологическое исследование что это такое? Это метод диагностического анализа биологического образца пациента на предмет наличия антител и антигенов. Тест позволяет выявить десятки заболеваний, фазу болезни и контролировать лечение.

Для чего назначается исследование

Этот тип медицинского исследования широко применяется в различных областях медицины. Реакция связывания комплемента или РСК направлена на выявление в сыворотке крови специфических клеток, антител, которые вырабатывает организм для борьбы с инфекциями и вирусами.

Изосерологическое исследование направлено на определение группы крови, резус-фактора и других параметров крови пациента.

• Серологический анализ крови используется в гинекологии для выявления заболеваний, передающихся половым путем. Также серологическое титрование используется для комплексного обследования будущих мам (токсоплазмоз, ВИЧ, сифилис и пр.). При постановке на учет беременных, это обязательный тест.
• В педиатрии серологические реакции применяются для подтверждения диагноза «детских» болезней (ветрянка, краснуха, корь и пр.), если симптомы выражены не ярко и нет возможности определить недуг по клиническим показаниям.
• Серологические исследования позволяют венерологам быстро и безошибочно ставить диагноз. При схожих симптомах и жалобах анализ крови позволяет выявить антитела к сифилису, лямблиозу, уреплазмозу, хламидиозу, герпесу и другим заболеваниям.
• Гастроэнерологи, гепатологи и инфекционисты используют серологический анализ крови для диагностики вирусного гепатита.
• Подозрение на любое инфекционное или вирусное заболевание может возникнуть у терапевта. Для подтверждения используются серологические реакции на специфические антитела в организме. Проводится анализ на энцефалит, бруцеллез, коклюш, вирус Денге, вирус иммунодефицита, аллергию и пр.
• Серологическая диагностика для госпитализации играет важную роль. Этот метод диагностики может показать, на какой стадии развития находится болезнь, и требуется ли немедленное оформление в стационар или достаточно амбулаторного лечения.

В качестве биологического материала для исследования может использоваться образец слюны и кала, но чаще всего используется венозная кровь пациента. Анализ для серологических реакций должен браться из локтевой вены в лабораторных условиях. Перед тем как сдать анализ следует проконсультироваться с лечащим врачом и подготовиться.

Подготовка к анализу

Этот тип исследования проводится как в муниципальных, так и в коммерческих учреждениях. Выбор лучше сделать в пользу той лаборатории, которая располагает самым современным оборудованием и имеет только положительные отзывы о своей работе. Для занятых пациентов лаборатория может предоставлять услуги по забору крови на РСК дома.

В этом случае пациенту не приходиться тратить время на дорогу, а очереди исключены.

Подготовка к забору венозной крови включает в себя несколько общих правил. Перед тестом нельзя употреблять пищу, то есть анализ берется натощак. Сдавая кровь необходимо находиться в состоянии спокойствия и не волноваться. Перед процедурой не следует проходить другие процедуры (рентгенография, ультразвуковое обследование и пр.). За несколько недель до забора крови по согласованию с лечащим врачом отменяется прием лекарственных препаратов. Некоторые рекомендации зависят от болезни, на которую проводится тест. Например, при исследовании на гепатит за 2 дня до анализа из рациона исключают жирную пищу и алкоголь.

Реакция флюоресценции

Один из видов серологических реакций флюоресценция или РИФ. Этот метод исследования проводится с использованием реагента, который подсвечивает искомые антитела в сыворотке крови. Для постановки серологической реакции прямого типа или ПИФ специфические антитела помечаются флюоресцирующим веществом. Это самый быстрый тип исследований, который проводится в один этап.

Другой способ, который называется непрямым или РНИФ, проводится в 2 стадии. На первой специфические клетки (антитела) не имеют флюоресцирующих меток, а на второй используются соответствующие меченые антитела для выявления комплекса антиген-антитело. Реакция свечения появляется только после связи со специфическим антителом. Результат манипуляций оценивается специальным прибором, который оценивает интенсивность излучения, а также определяет форму и размер исследуемых объектов. Инфекционный агент определяется с достоверностью 90-95% в зависимости от типа и стадии заболевания.

Иммуноферментный анализ

Для исследования ИФА серологические реакции проводятся с использованием уникальных стабильных реагентов. Вещества с меткой присоединяются к определенному (искомому) типу антител. В результате серология дает качественную или количественную оценку по образцу крови пациента. Если субстрат не имеет выраженных маркеров, результат считается отрицательным. В случае качественного исследования положительный результат означат только присутствие антител в биологическом образце.

Серодиагностика с количественным определением клеток антител дает более полную картину. По сумме выявленных клеток врач может сказать находится ли заболевание в начальной стадии, острой или это обострение хронической формы болезни. При постановке диагноза также учитывается киническая картина и жалобы пациента.

Особенности исследований

При исследовании на бруцеллез проводится контроль сыворотки крови на самозадержку без антигена. Это позволяет повысить достоверность теста. Результат анализа на бруцеллез может быть положительным, отрицательным или невыраженным, то есть вызывающим сомнения. При получении сомнительных результатов, рекомендуется повторный забор крови. Также бруцеллез диагностируется по результатам посева крови, исследования костного мозга и спинно-мозговой жидкости.

Достоинства и недостатки серологии

Диагностика с применением серологических методов широко используется в современной медицине. Особенно актуален этот тест при выявлении вирусных и инфекционных заболеваний. Этот же тип анализов используется при географических скринингах и медицинских обследованиях для предотвращения эпидемиологических вспышек.

Серологические анализы имеют ряд преимуществ.

• Серологический тест любого типа имеет высокую достоверность.
• Анализы на серологию проводятся достаточно быстро. Результат РСК известен уже через сутки, а получить его можно посредством интернета, не выходя из дома. В особых случаях при стационарном лечении тест проводится в течение нескольких часов.
• РСК позволяет контролировать развитие болезни, и отслеживать эффективность проводимого лечения.
• Серологические методы исследования отличаются невысокой стоимостью и доступны пациентам.

Серологические анализы имеют и некоторые недостатки. Для того, чтобы обследование дало максимально достоверную информацию анализ крови следует проводить с учетом времени инкубационного периода болезни.

Простой герпес 1 и 2 типа можно определить только спустя 2 недели после заражения, а исследование на вирус иммунодефицита проводится спустя 1, 3 и 6 месяцев после контакта с больным.

На достоверность исследования может повлиять человеческий фактор. Если пациент пренебрегает правилами подготовки к исследованию или лаборант допустил ошибку в обработке образца крови, возможно получение ложного или сомнительного результата. Такая ситуация возникает приблизительно в 5% случаев. Как правило, лечащий врач на основании клинических показаний легко вычисляет ошибку РСК.

Серологическое исследование крови современный и надежный способ выявления таких опасных заболеваний как ВИЧ, гепатит, бруцеллез, ЗППП и пр. Этот раздел медицины направлен на изучение плазмы крови человека и ее иммунологических свойств. Серологический метод широко распространен, а стоимость исследований в частных лабораториях сравнительно невысока. Для проведения анализа используется современное оборудование, которое сводит к минимуму влияние человеческого фактора на результаты исследований.

Вконтакте

Более простой и доступный подход - выявление противовирусных антител (AT) в сыворотке . Образцы крови необходимо отбирать дважды: немедленно после появления клинических признаков и через 2~3 нед. Чрезвычайно важно исследовать именно два образца сыворотки. Результаты однократного исследования нельзя считать окончательными из-за невозможности связать появление AT с настоящим случаем. Вполне возможно, что эти AT циркулируют после предшествующей инфекции. В подобной ситуации роль исследования сыворотки, полученной в период рекон-валесценции, трудно переоценить. На наличие заболевания в период отбора первой пробы указывает не менее чем четырёхкратное увеличение титра AT, выявленное при исследовании второй пробы.

Перечисленные ниже методы не позволяют дифференцировать антитела (AT), образующиеся во время болезни и циркулирующие после выздоровления (продолжительность этого периода вариабельна для различных инфекций). Поскольку для адекватной диагностики необходимо подтвердить достоверное увеличение титров AT в двух пробах, то первую пробу исследуют в острой фазе, а вторую - в период выздоровления (через 2-3 нед). Полученные результаты носят ретроспективный характер и более пригодны для проведения эпидемиологических обследований.

РТГА выявляет AT, синтезируемые против гемагглютининов вирусов (например, вируса гриппа). Метод позволяет легко выявлять подобные антитела (AT) в сыворотке больного.

РСК - основной метод серодиагностики вирусных инфекций (среди доступных). Реакция выявляет комплементсвязывающие IgM и IgG, но не дифференцирует их; для оптимизации получаемых результатов постановка реакции требует определённых навыков персонала.

РИФ . При возможности получить биоптат инфицированной ткани и доступности коммерческих наборов AT, меченных флюоресцеином, диагноз может подтвердить реакция прямой иммунофлюоресценции. Постановка реакции включает инкубацию исследуемой ткани с AT, их последующее удаление и люминесцентную микроскопию образца.

Иммуносорбционные методы выявления противовирусных антител

Иммуносорбционные методы (например, ИФА и РИА) более информативны, поскольку выявляют IgM и IgG по отдельности, что позволяет делать определённые выводы о динамике инфекционного процесса или состоянии реконвалесценции. Для выявления AT известный Аг сорбируют на твёрдом субстрате (например, на стенках пробирок, пластиковых микропланшетах, чашках Петри) и вносят различные разведения сыворотки пациента. После соответствующей инкубации несвязавшиеся AT удаляют, вносят антисыворотку к Ig человека, меченную ферментом, повторяют процедуру инкубирования и отмывания несвязанных AT и вносят какой-либо хромогенный субстрат (чувствительный к действию фермента). Поскольку изменение окраски пропорционально содержанию специфических AT, то вполне возможно определение их титра спектрофотометрическим способом. В диагностике ВИЧ-инфекции наи- большее распространение нашёл метод иммуноблотннга.

Серология (от лат. serum — «сыворотка», logos — «наука») представляет собой раздел иммунологии, который изучает специфику взаимодействия сывороточных антител с антигенами.

Основа диагностики — обнаружение специфических антител, которые образуются в качестве реакции на инфицирование организма определенным антигеном. В зависимости от того, какие антитела обнаружены в крови, делается вывод о характере инфекции, а количество этих антител говорит о степени активности инфекционного заболевания.

Материал, взятый на исследование в рамках серологического анализа крови, изучается на предмет , и других опасных заболеваний — герпеса, кишечных инфекций, краснухи, токсоплазмоза, хламидиоза, кори, хламидиоза. Кроме того, это исследование позволяет утвердить группу крови, определить специфичность белков.

Итак, серологические исследования проводят:

• если поставлен предварительный диагноз и теперь требуется его подтверждение. Исследование основывается на добавлении соответствующего антигена в сыворотку крови. Ответная реакция позволяет сделать вывод о налиии или отсутствии заболевания;
• если диагноз поставить не удается. В рамках исследования в кровь добавляют антитела и определяют вид антигенов, что позволяет определить конкретное заболевание;
• если необходимо .

Таким образом серологический анализ крови помогает поставить диагноз или назначить наиболее эффективное лечение — при минимальных временных и финансовых затратах.

К достоинствам серологических исследований можно отнести:

• возможность выявления патологических микроорганизмов на ранних стадиях инфекции;
• контроль развития заболевания и уровень эффективности проводимой терапии;
• отсутствие необходимости специальной подготовки перед взятием биоматериала;
• оперативность. Результат будет доступен через два-три часа, что в условиях стационарного лечения очень важно;
• финансовую доступность реагента, что позволяет проводить пробы так часто, как это нужно;
• отсутствие противопоказаний.

Как проводится серологическое исследование

Забор крови проводится из локтевой вены. Важный момент — кровь берется не шприцом, а самотеком — в вену вводится игла без шприца и собирается в пробирку до пяти мл крови. Проводится процедура с утра .

В зависимости от реакций, которые лежат в основе исследования, выделяют несколько видов процедур:

1. реакция нейтрализации . Основывается на свойстве антител иммунной сыворотки реагировать как нейтрализующее средство на микроорганизмы или токсины, предупреждая их негативное воздействие на организм;
2. реакция агглютинации . Может быть прямой или непрямой. В первом случае речь идет об изучении сыворотки крови на предмет присутствия антител (осуществляется вброс убитых микробов в материал, и оценивается реакция — если есть осадок в виде хлопьев, реакция положительная), непрямая реакция основана на введении в материал эритроцитов с адсорбированными на них антигенами (фестончатый осадок говорит о положительной реакции);
3. реакция преципитации . Раствор антигена наслаивается на иммунную сыворотку (выполняет роль жидкой среды). Используется растворимый антиген. Если комплекс антиген-антитело выпадает в осадок, реакция считается положительной;
4. реакция с участием комплемента. Область применение — обнаружение инфекционных заболеваний. Активируется комплемент и исследуются реакции;
5. реакция с мечеными антигенами и антителами . Основывается на том, что антигены тканей или микробы, обработанные особым образом, начинают излучать свет под воздействием УФ-лучей. Метод широко применяется не только при диагностике антигенов, но также для определения гормонов, ферментов, лекарственных средств.

К сдаче анализа необходимо подготовиться: за четыре дня пациент должен отказаться от приема сердечных препаратов, нужно также исключить алкоголь в любом его проявлении, острую и жирную еду, сладости, ограничить физические усилия, избегать стрессов.

Если не соблюдать эти правила, повышается риск ложноположительного результата. Перед назначением повторной сдачи анализов врач обязательно должен выяснить, что делал пациент за день до процедуры, и дать рекомендации по правильной подготовке к обследованию.

Серологический анализ: расшифровка

Серологическое исследование крови — анализ, который позволяет определить/подтвердить тип возбудителя инфекции, помогает специалисту поставить диагноз. Это незаменимая помощь, если врач не может подобрать лекарственную терапию, так как возбудители различных заболеваний отличаются разной чувствительностью к действию конкретных лекарств и антибиотиков.

После того, как процедура сбора материала закончена, лаборанты приступают к следующему этапу — расшифровывают показатели. Так, если в крови у пациента антитела не обнаружены, можно делать вывод, что в организме нет инфекций — результат анализа в таком случае положительный.

Но такое положение вещей, скорее, исключение из правил: если есть симптомы заболевания, серологические исследования выявляют и доказывают наличие серьезной патологии в организме.

Сначала в организме с помощью анализа находят возбудителей заболеваний, далее оценивают количество антител, на основании чего делают вывод о том, насколько серьезно развита инфекция.

Серологическое исследование на гепатит, ВИЧ, сифилис: особенности

Сифилис . При проведении анализа на сифилис специалисты ищут белки, отвечающие за поступление в человеческий организм возбудителя инфекции — речь идет о трепонеме бледной. В качестве биологического материала в этом случае выступает сыворотка крови.

. Вирусные гепатиты — серьезные инфекционные заболевания, опасность которых заключается в том, что они достаточно долгое время могут жить в организме, никак себя не проявляя. Выявить заболевание в ранней фазе, когда оно лучше поддается лечению, можно проведя анализ на маркеры — маркеры появляются в крови после перенесенного заболевания или введения вакцины.

Нужно понимать , что выявление возбудителя возможно только через 1,5-2 месяца после инфицирования. Если анализ сдает беременная женщина, возможен ложноположительный результат.

Рекомендуем к просмотру медицинский сайт https://tabletix.ru/ . На сайте найдете полезную информацию, врачебные мнения.
Если вы наблюдаете один или несколько из симптомов, указанных ниже, стоит задуматься о сдаче серологического анализа:

• рвота;
• плохой аппетит или его отсутствие;
• беспричинное бессилие организма, переутомление;
• желтоватый цвет лица;
• изменения цвета кала и мочи.

ВИЧ. Если показал положительный результат, это не говорит о том, что пациент инфицирован СПИДом. Если заражение произошло недавно (не более двух месяцев назад), наличие антител не позволяет определить факт развития заболевания. Назначается повторное исследование.

Серологический анализ крови — важнейший метод исследования, основное назначение которого заключается в оперативном выявлении вирусов, инфекций, микробов в организме.

Этот уникальный лабораторный «инструмент» позволяет определить любое заболевание, которое является следствием угнетения иммунитета, поэтому не ленитесь, а регулярно сдавайте анализ, чтобы иметь возможность вовремя выявить болезнь и быстро от нее избавиться.

8 057

Серологическое исследование, или, другими словами - серологический анализ, это исследование биологических материалов в лаборатории. Этот анализ позволяет установить наличие болезнетворных бактерий в исследуемом организме, либо - в продуктах, которые проходят контрольную проверку.

Серологические методы диагностики

Исследование сывороток или других биологических объектов (молока, желчи, слюны, смывов слизистой кишечника, а также - копроматериалов) дает достаточно достоверное представление об ответе организма на внедрение инфекционного агента. Следует отметить, что применение серологических методов исследования имеет не только диагностическое значение, но дает достоверные сведения об уровне защиты организма, состоянии популяционного иммунитета, циркуляции различных типов ротавирусов в обследуемом регионе. Результаты серологических обследований могут также дать информацию для оптимизации антигенного состава профилактических препаратов и использоваться с целью оценки иммунологической эффективности вакцин.

Однако нужно отметить, что необходимость исследования парных сывороток крови, забираемых с интервалами 1,5-2 недели, и наличие экспрессных методов диагностики снижают диагностическую ценность серологических реакций.

Поэтому традиционные серологические тесты - реакции связывания комплемента (РСК) и реакция торможения гемагглютинации (РТГА), находят в настоящее время лишь ограниченное применение. Тем не менее простота этих методов, доступность и дешевизна реагентов делают их еще применимыми в лабораторной практике. Постановка РСК и РТГА осуществляется по общепринятым методикам.

Примером использования РСК для изучения поствакцинального иммунитета является работа К. Мидхана (1989 г.). При обследовании сывороток от 116 детей в возрасте 5 месяцев достоверные сероконверсии, по данным РСК, были отмечены в 44% случаев, а по результатам реакции нейтрализации (PH) и имму-ноферментного анализа (ИФА) - в 83 и 96% соответственно.

Исследование иммунитета

С целью изучения популяционного иммунитета с помощью РСК нами было обследовано 1246 сывороток больных ОКЗ в возрасте от нескольких месяцев до 80 лет и старше. Показано, что среднегеометрические титры комплементсвязывающих антител были наиболее высокими в возрастных группах 2 - 4 и старше 60 лет, что подтверждает полученные нами ранее данные о наибольшем распространении ротавирусной инфекции среди лиц указанных возрастных групп.

Анализ на ротавирус

РТГА используется в изучении ротавирусной инфекции чаще, чем РСК, и, как правило, в сочетании с другими лабораторными тестами. Так, Andrade J. Р. et al. применили РТГА, иммуно-блот, блок ИФА для изучения антител к структурным белкам ротавируса VP2, VP4, VP6 й VP7. По данным авторов, у детей от 2 до 4 лет обнаружили антигемагглютинирующие антитела к ротавирусам в 70-80%.

В зависимости от уровня антител к определенным белкам, по данным РТГА, авторы выделили 4 группы лиц. В I и II группы (60%) вошли дети с высоким уровнем антител к VP4 и VP7 и были классифицированы как «иммунные». В III группу (4%) отнесены лица с низким уровнем антител к VP7 и VP6, так называемые «частично иммунные». Дети IV группы (36%), у которых, по данным РТГА, антитела не были обнаружены, обозначены как «неиммунные» и составили группу риска, т. к. среди них возможно развитие выраженной ротавирусной инфекции. Следует отметить, что в данном наблюдении показатели чувствительности РТГА и блок ИФА были вполне сопоставимы.

РТГА неоднократно использовали для изучения структурного белка VP4. Исследования показали, что его гемагглютинирующая активность специфически ингибируется антисывороткой, тем самым подтверждая, что VP4 является гемагглютинином ротавирусов. Аналогичные данные были опубликованы ранее М. Езекиелем (1995 г.).

Таким образом, представленные работы показывают, что РСК и РТГА все еще применяют при изучении ротавирусной инфекции, однако эти методы носят вспомогательный характер и должны дублироваться другими тестами.

Нейтрализационные тесты

Реакция нейтрализации основана на способности иммунных сывороток человека или животных нейтрализовать репродукцию вируса и тем самым предотвратить связанные с этим феноменом проявления. В зависимости от биологической модели этими проявлениями могут быть: развитие заболевания со специфической клиникой, репродукция и выделение вируса, выработка специфических антител, а также появление цитопатического эффекта или образование пляк при использовании культуры клеток.

Макробиологические модели в настоящее время применяются преимущественно в ветеринарии, обнаружение вирусов у людей в большинстве случаев проводится на культуре клеток, как первичных, так и переливаемых. Методы PH подразделяются на две группы по принципиальной схеме постановки. В одной группе методов неразведенная сыворотка соединяется с серийными разведениями вируса, в другой - разведения сыворотки испытываются с постоянной дозой вируса. Для постановки реакции нейтрализации предпочтителен возбудитель, вызывающий выраженный цитопатический эффект или интенсивно репродуцирующийся в биологической модели.

Однако ротавирусы, к сожалению, обладают слабо выраженным цитопатическим эффектом, что убедительно продемонстрировали исследователи под руководством Б. Вебера (1992 г.). Исследование 121 пробы кала больных ОКЗ детей с использованием классического метода выделения вируса на клетках МА-104 под контролем ЦПД выявило только 4 положительных случая (3,3%), тогда как применение современных методов обнаружения ротавирусов (ИФА, ПЦР, ЭФ в ПААГ) позволило повысить этот показатель до 54,4%. Следовательно, для повышения чувствительности PH требуются дополнительные методические приемы, способствующие визуализации редукции вируса, в качестве которых используются: радиоактивная или иммунофлюоресцентная метка, плякобразо-вание, иммунопероксидазная окраска и т. д. При этом следует отметить, что сам принцип определения уровня вируснейтрализующих антител идентичен классическому методу PH, отличаясь от него только способом разрешения, то есть, визуализацией вируснейтрализующей активности сыворотки. В этом случае активность сыворотки определяют по ее способности подавлять проявления инфекционных свойств вируса.

В настоящее время в большинстве исследований используются два метода измерения количества вируснейтрализующих антител к ротавирусу. Один из них основан на подсчете числа индивидуальных вирусинфицированных клеток (метод пляк), специфически связывающихся с антителами, конъюгированными флюоресцентом. В другом тесте об уровне нейтрализации вируса судят по снижению продукции вирусного антигена им-муноферментным методом. Сравнительное изучение обоих методов показало линейную зависимость между показателями ИФА и числом пляк-формирующих единиц для каждого прото-типного штамма серотипа ротавируса: Wa, DS-1, Р, VA-70. Полученные данные позволяют легко определить разведение сыворотки, обеспечивающее нейтрализацию 60% инфекционного вируса (нейтрализующий титр антител). Оказалось, что титры антител при тестировании материалов обоими методами одинаковы и оба теста не различаются по воспроизводимости результатов. Некоторое преимущество метода с использованием антител, меченных флюоресцеином, по мнению авторов, заключается в большей объективности учета результатов (автоматизированная регистрация) и в меньшей трудоемкости.

Для измерения титров вируснейтрализующих антител используют и модифицированную PH посредством блокирования ИФА с помощью моноклональных антител.

• изучению интенсивности выработки вируснейтрализующих антител (ВНА) при естественной инфекции и вакцинации;
• образованию ВНА к различным структурным белкам ротавирусов;
• оценке роли ВНА сывороток крови и секреторных антител слюны и слизистой кишечника в защите от естественной инфекции (Ward R. et al., 1990, 1992, 1993, 1995, 1997).

В заключение необходимо подчеркнуть, что реакция нейтрализации в различных ее модификациях до настоящего времени широко используется как в экспериментальных, так и клинических исследованиях и, обладая высокой чувствительностью и специфичностью, служит эталоном для всех других серологических методов.

Преципитационный анализ

Преципитационные тесты основаны на взаимодействии сыворотки с вирусными антигенами при помощи осмотических процессов или под влиянием электрического поля в гелевой среде или другого вида носителя. Одним из таких методов является реакция встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ). Авторы исследовали сыворотки крови здоровых и больных ротавирусной диареей взрослых и детей, а также препараты специфического иммуноглобулина на наличие антител к человеческому ротавирусу методом ВИЭФ в 7% агарозе с добавлением 4% полиэтиленгликоля. Оказалось, что антитела к RV циркулировали достаточно широко и обнаружены у больных взрослых и детей в 90,2-87,7% соответственно, а также у 78,4% здоровых детей в возрасте до 1 года. Все 32 серии иммуноглобулина содержали антитела к РВ в титрах 1:4- 1:128. По мнению авторов, метод пригоден для изучения популяционного иммунитета.

Радиоиммунопреципитация

Другой преципитационной методикой является радиоиммунопреципитация. Авторы использовали этот метод для изучения иммунного ответа к структурным и неструктурным белкам при первичной ротавирусной инфекции и показали, что иммунный ответ был более выражен к VP4, чем к VP7.

При изучении сывороточного и секреторного иммунологического ответа на применение тетравалентной реассортантной вакцины у новорожденных Для этого была использована радиоиммунологическая техника исследования наряду с ИФА и PH. При этом было показано, что иммунный ответ в сыворотке зависит от дозы вводимого антигена; что же касается выявления антител в слюне, то авторы объясняют их появление с потреблением грудного молока.

Реакция радиоиммунопреципитации используется и в тонких научно-исследовательских работах. Так, Дж. Тоссер использовал этот метод для изучения топологии белка VP6 в структуре генома и высказали предположение, что VP 6 участвует в образовании каналов внутреннего капсида.

Другие исследователи в 1994 году также использовали метод радиоиммунопреципитации для изучения иммунологических сдвигов при ротавирусной инфекции. Авторы показали, что в остром периоде регистрируются, главным образом, IgA к VP2 и VP6, в то время как в период реконвалесценции снижалась интенсивность выработки секреторных антител (IgA) не только к VP2, но и к остальным структурным и неструктурным белкам. Позднее аналогичные данные были получены с применением радиоиммунопреципитационного метода. Авторы показали, что в иммунологическом процессе, помимо VP4 и VP7, участвуют также VP2, VP6 и NSP2.

Таким образом, иммунопреципитация использовалась в диагностических целях для изучения иммунного ответа при естественной ротавирусной инфекции.

В последние годы иммунопреципитацию заменил метод радиоиммунопреципитации, который применяется для оценки поствакцинального и постинфекционного иммунитета при RV инфекции и для тонких научно-исследовательских разработок.

Гибридизационные методы

Для определения антител к ротавирусам широко применяют метод иммуноблота. Примером использования Western-blot в диагностике ротавирусной инфекции служит работа Х. Ушижимы (1989 г.), который, с помощью иммуноблотинга, охарактеризовал специфичность антител к структурным белкам RV у 21 ребенка с ОКЗ, а также уровень копроантител классов IgA и IgG к этим белкам у неинфициро-ванных детей. Авторы высказали предположение, что иммуно-блотинг может позволить установить диагноз заболевания по одной пробе копроантител без исследования парных сывороток крови. Возможность применения Western-blot для определения уровня антител к VP1, VP2, VP4, VP6 и VP7 была продемонстрирована Павловым И. и др. (1991 г.). Авторы исследовали сыворотки крови людей и животных на наличие антител к штаммам ротавирусов SA-11, DS-1, Wan Ito и пришли к выводу, что Western-blot может быть с успехом использован для оценки иммунитета в клинической практике.

Полагают, что иммуноблот может быть использован для подтверждения диагноза ротавирусной инфекции без использования парных сывороток по одной пробе копроантител.

Наряду с РТГА и ИФА, иммуноблот использовали для изучения популяционного иммунитета. Обнаружена группа лиц, неиммунных по отношению к VP2, VP4, VP6 и VP7, которые представляют группу риска, в первую очередь требующую защиты средствами активной и пассивной иммунизации (Andrade J. Р. et al., 1996).

Применение иммуноблота в изучении серологических сдвигов в процессе естественной RV инфекции отмечают и Begue R. et al. (1998). Авторы подтвердили, что в иммунном ответе на инфицирование участвуют наиболее часто антитела к VP2 и VP6, менее часто - к VP7 и VP4.

Иммунофлюоресцентный анализ

Иммунофлюоресцентный метод в непрямом варианте с использованием антивидовых сывороток, меченных флюорохромом, применяется для титрования испытуемых сывороток на клетках, зараженных ротавирусами. В основе реакции лежит специфическое взаимодействие меченых антител и гомологичного антигена, при этом комплекс антиген-антитело легко обнаруживают с помощью люминесцентного микроскопа.

Используя этот метод, авторы провели серологическое обследование двух групп южно-американских индейцев и выявили высокий процент серопозитивных лиц в обеих группах: 67,8 и 77,4% по данным ИФА и 45,5 и 56,7% по результатам ИФМ соответственно.

В другом исследовании, посвященном определению уровня антител к RV группы С в пуповинной крови с помощью ИФМ, было показано, что у 30% женщин детородного возраста выявлялись эти антитела, свидетельствующие о перенесенной инфекции.

Иммуноферментный анализ используется в настоящее время наряду с PH в серологической диагностике ротавирусной инфекции чрезвычайно широко. Этот метод, основанный на использовании антител или антигена, меченных ферментом, благодаря простоте выполнения и экономичности наиболее приемлем и перспективен для серологической диагностики ротавирусной инфекции. Метод позволяет проводить массовые сероэпидемические обследования населения, оценивать иммунологическую и эпидемиологическую эффективность вакцин, изучать защитную роль антител различных классов в различных биологических жидкостях человеческого организма, а также осуществлять серологическую диагностику ротавирусной инфекции.

Многочисленные исследования с помощью ИФА были проведены Р. Азередо (1989 г.), которые показали, что число больных ОКЗ установленной ротавирусной этиологии было значительно ниже уровня их инфицированности по результатам серологического обследования. Эти данные обнаружили, что многие клинические случаи ротавирусной инфекции не диагностируются методом обнаружения RV в фекалиях. Дальнейшие исследования по изучению распространенности ротавирусной инфекции подтвердили это предположение. При проведении сероэпидемиологических обследований было обнаружено, что 50- 70% населения обладали высоким уровнем антител, что свидетельствует о широкой циркуляции RV в человеческой популяции.

Еще большие возможности открывает ИФА при определении динамики уровня антител, принадлежащих к различным классам иммуноглобулинов. Так, по данным авторы методики в 1989 году утверждают, что в процессе вакцинации достоверный прирост антител к RV в крови отмечался в 83-96%. Антиротавирусные антитела классов IgA и IgG одинаково хорошо выявляли ИФА и PH по редукции пляк - 67,6 и 70,0% соответственно. Сероконверсия антител класса IgM была обнаружена у 53 и 44% детей методами ИФА и РСК соответственно. По результатам анализа интенсивности выработки антител разных классов авторы сделали вывод, что наиболее эффективным, простым и быстрым методом выявления сероконверсий после вакцинации является способ обнаружения IgA антител с помощью ИФА.

Этот вывод нашел свое подтверждение и в работе Р. Бишопа (1996 г.), в которой указано, что по результатам обследования 68 пар мать-дитя с диагностированной RV инфекцией показано, что обнаружение антител класса IgA с помощью ИФА в копроматериалах служит наиболее чувствительным маркером как клинически выраженной, так и бессимптомной инфекции. Аналогичные результаты при обследовании детей с выраженной RV диареей были получены Дж. Коломиной в 1998 году.

Однако для изучения интенсивности сероконверсий необходимо исследование парных сывороток, что значительно удлиняет процесс диагностики. В то же время общеизвестно, что появление антител класса IgM является свидетельством начала инфекционного процесса. По нашим данным, полученным при обследовании больных ротавирусной инфекцией методами ИФА и РСК, оказалось, что, по результатам ИФА, все обследованные лица содержали в крови IgM антитела к RV, в то время как по данным РСК - только в 77% (Р

В последние годы с реализацией возможности определения гено- и серотипоспецифических антител ИФА стал поистине универсальным методом изучения ротавирусной инфекции, который используется:

• при изучении выработки антител классов IgA, М, G к отдельным структурным и неструктурным белкам RV;
• в оценке иммунологической эффективности различных видов вакцин: аттенуированных, холодоадаптированных, ДНК-овых, реассортантных;
• при изучении выработки антител в различных биологических жидкостях организма в условиях естественной инфекции и при иммунизации.

Таким образом, как следует из представленных данных, и иммунологические аспекты ротавирусной инфекции изучают при помощи широкого спектра лабораторных методов. Вследствие этого выбор оптимального метода исследования с учетом его разрешающей возможности, экономических и временных затрат достаточно сложен и зависит от задач, стоящих перед исследователями, а также оснащенности лаборатории. И все же из многообразия методов, на наш взгляд, следует выделить два - реакцию нейтрализации на культуре клеток и иммуноферментный анализ, - обеспечивающих изучение антител к различным классам иммуноглобулинов. Особую перспективность этих методов для использования в широкой практике определяет реализованная возможность экспресс-диагностики ротавирусной инфекции.

С целью установления точного диагноза, больного обследуют комплексно. Общий анализ крови малоинформативен, его не используют при диагностировании венерической инфекции.

Виды исследований и биоматериалов для анализа

Для выявления болезни используют различные методики и биоматериалы. На ранних этапах сифилис определяют с помощью бактериоскопического теста. Образцы исследуют под микроскопом. Прибор позволяет обнаружить штаммы возбудителя. Позднее проводят серологические анализы. Благодаря им, в пробах выявляют антигены и антитела к болезни.

Способы определения половой инфекции поделены на 2 категории:

• Прямые, выявляющие патогенный микроорганизм. К ним относят: темнопольная микроскопия, RIT-анализ (инфицирование кроликов биоматериалом для исследования), метод ПЦР – полимеразной цепной реакции (с его помощью находят генетические элементы возбудителя).
• Непрямые (серологические) позволяют обнаружить антитела к патогену. Они продуцируются иммунной системой, как ответная реакция на заражение.

Серологические методики поделены на 2 категории: трепонемные и нетрепонемные.

Нетрепонемные, включающие: тест с толуидиновым красным, анализ РСК, RPR- тест, исследование крови экспресс-методом РМП.

Трепонемные, объединяющие: иммуноблоттинг, РСК-тест, РИТ-анализ, исследование РИФ, РПГА-тест, ИФА-анализ.

Информативность тестов на инфекцию различна. Чаще делают основные виды анализов на сифилис, к которым отнесены серологические методики. Пациентам, нуждающимся в обследовании, врач назначает тесты индивидуально.

Биоматериал для исследования

Чтобы выявить бледную трепонему – патогена, который выглядит, как спираль и вызывает сифилис, берут пробы:

• венозной крови;
• ликвора (секрета из спинномозгового канала);
• содержимое лимфатических узлов;
• ткани изъязвлений.

Если необходимо провести тесты на обнаружение сифилиса, кровь сдают не только из локтевой вены, но и из пальца. На выбор биоматериала и способ исследования влияет тяжесть течения инфекции и оснащенность диагностического центра.

Прямые исследования

Убедительным доказательством сифилиса является выявление возбудителей инфекции под микроскопом. Таким способом находят патоген у 8 обследуемых из 10. Отрицательный результат у 2 оставшихся пациентов не говорит о том, что они не инфицированы.

Исследование делают на первичном и вторичном этапе (стадии) заболевания, для которых характерно появление высыпаний на коже и сифилом (изъязвлений) на эпителиальных тканях или слизистых оболочках. В отделяемом из очагов поражения находят патогены, вызывающие венерическое заболевание.

Точнее с определением трепонем справляется сложный тест, обозначающийся как РИФ – реакция иммунофлуоресценции. Образец для исследования предварительно обрабатывают флуоресцентными антителами. Соединения, способные светиться, склеиваются с бактериями. Рассматривая под микроскопом образцы, в случае заражения лаборант видит сверкающих возбудителей.

Тест используют для раннего диагностирования болезни. Чем дольше длится заболевание, тем ниже чувствительность исследовательских способов. Кроме того, она падает после обрабатывания высыпаний и язв антисептическими средствами и у пациентов, прошедших лечение. Изредка исследование дает ложноотрицательные и ложноположительные результаты.

RIT-анализ – высокоточный способ обнаружения сифилиса. При проведении теста результаты приходится ждать долго. До тех пор, пока у инфицированного кролика не проявятся признаки инфекции. Тест применяют очень редко, несмотря на то, что он сверхточен.

С помощью полимеразной цепной реакции на сифилис определяют генетические элементы патогенов. Единственный недостаток ПЦР – дороговизна.

Нетрепонемные тесты

Такие анализы крови помогают выявить антитела, появляющиеся в ответ на кардиолипин – соединение, относящееся к общему строению мембран патогенов.

Реакция Вассермана (РВ или RW)

Самым известным исследованием на сифилис считается реакция Вассермана. РВ входит в категорию реакций связывания комплемента (РСК). Новые методы РСК обладают существенными отличиями от традиционной RW. Но обозначаются они, как и раньше понятием «реакция Вассермана».

Иммунная система, синтезирует антитела (маркеры) в ответ на вторжение трепонем. Их выявляют при анализе крови на сифилис методом реакции Вассермана. Положительный результат RW подтверждает инфицирование обследуемого.

Реакция гемолиза – индекс РВ анализа. При ней взаимодействуют 2 субстанции: гемолитическая сыворотка и эритроциты барана. Сыворотку делают, иммунизируя кролика эритроцитами барана. Активность биологической жидкости снижают путем прогревания.

Показатели РВ зависят от того, прошел гемолиз или нет. В пробе чистой от маркеров происходит гемолиз. При этом реакция на антигены невозможна. Комплемент тратится на взаимодействие с бараньими эритроцитами. Когда в образце есть маркеры, комплимент вступает в реакцию с антигенами. В этом случает гемолиз не протекает.

Компоненты для RW отмеряют в равном количестве. Образец, содержащий сыворотку, антиген и комплимент, прогревают. Добавляют в пробу бараньи эритроциты и сыворотку. Держат при температуре 37 градусов, пока не наступит гемолиз в контрольном образце, который вместо антигена содержит физраствор.

Для проведения РВ используют готовые антигены. На упаковках указывают титры и технологию их разбавления. Позитивный результат RW обозначается крестиками. Готовые результаты тестов обозначаются следующим образом:

• ++++ – максимально позитивные (гемолиз задержался);
• +++ – положительные (гемолиз существенно запаздывает);
• ++ – слабо позитивные (гемолиз частично промедлил);
• + – сомнительные (гемолиз припозднился незначительно).

При отрицательной РВ гемолиз полностью осуществился во всех образцах. Но в некоторых случаях получают ложноположительные данные. Такое происходит, когда кардиолипин входит в состав клеток. Защитные механизмы не продуцируют маркеры к «родному» кардиолипину.

Однако изредка возникают исключительные ситуации. Положительную RW выявляют у незараженных людей. Такое возможно, если пациент перенес тяжелую болезнь, вызванную вирусами (пневмонию, малярию, туберкулез, патологии печени и крови). Положительной РВ бывает у беременных. Обусловлено это тем, что иммунитет чрезмерно ослаблен.

Если возникает подозрение, что результат анализа на сифилис ложноположительный, пациента обследуют дополнительно. Проблема в том, что эту инфекцию невозможно выявить по единственному клинико-лабораторному тесту. Часть исследований дает ложные показатели, которые бывают, как отрицательными, так и положительными.

Получить достоверные данные помогает развернутый анализ на сифилис. Благодаря ему устанавливают истинный диагноз: доказывают заражение или исключают его. Кроме этого, расширенный тест позволяет остановить развитие инфекции, исключить проведение ненужной терапии.

РСК и РМП

Проводя обследование на сифилис, традиционную реакцию Вассермана применяют крайне редко. Вместо нее используют метод РСК. Анализ дает положительный результат спустя 2 месяца после инфицирования. При вторичной форме заболевания он положителен почти в 100% случаев.

Способ микропреципитации (РМП) – исследование с механизмом аналогичным реакции Вассермана. Методика проста в исполнении. Она быстро проводится. Для исследования кровь на сифилис в этом случае сдают из пальца. Методика дает положительный результат через 30 дней с момента появления сифилом. Ошибки при исследовании не исключены. Ложноположительные данные получают на фоне: обострившихся инфекций, пневмонии, инфаркта, инсульта, интоксикации.

К ошибочным тестам приводит:

Обнаружив сомнительный анализ на сифилис, делают трепонемные исследования. Они помогают уточнить диагноз.

RPR и тест с толуидиновым красным

Метод плазменных реагинов (RPR) – очередной аналог реакции Вассермана. Его применяют, когда необходимо:

• провести скрининг бессимптомных лиц;
• подтвердить сифилис;
• исследовать донорскую кровь.

Тест с толуидиновым красным, как и RPR, проводят, чтобы оценить динамику лекарственной терапии. Их показатели падают при отступлении болезни, и увеличиваются, когда патология рецидивирует.

Нетрепонемные анализы показывают насколько больной излечился. Получение отрицательных результатов на сифилис говорит о том, что болезнь отступила полностью. Первое обследование делают спустя 3 месяца после курсовой терапии.

Трепонемные исследования

Высоко результативные анализы проводят, используя трепонемные антигены. Их делают, когда:

• получен положительный результат при методе РМП;
• необходимо распознать ошибочные данные, возникающие при скрининговых тестах;
• подозревают развитие сифилиса;
• нужно диагностировать скрытно текущую инфекцию;
• надо провести ретроспективную диагностику.

Тесты РИФ и РИТ

У множества пролеченных больных трепонемные исследования проб дают положительные результаты долгое время. По ним нельзя судить о степени эффективности лечения. РИТ и РИФ – сверхчувствительные тесты. Благодаря им получают достоверные данные. Эти анализы трудоемки, они требуют приличных временных затрат, наличия прогрессивного оборудования. Их способны проводить квалифицированные медработники.

Выполняя РИФ анализ на сифилис, положительные данные получают спустя 2 месяца после инфицирования. Отрицательные параметры подтверждают, что обследуемый здоров. Положительные – позволяют предположить, что человек инфицирован.

РИТ проводят, когда реакция микропреципитации положительна. Такой анализ крови на сифилис помогает опровергнуть или удостоверить наличие инфекции. Тест сверхчувствителен, он точно указывает заражен пациент или здоров. Но исследование дает достоверные данные только через 3 месяца после проникновения трепонем в организм.

Метод иммуноблоттинга

К сверхточным тестам относят иммуноблоттинг. Такой анализ крови при сифилисе делают редко. Его применяют при обследовании новорожденных детей. Он не пригоден для экспресс-тестирования. Положительные результаты получают с опозданием. Их гораздо раньше дает метод микропреципитации.

ИФА и РПГА

К информативным сверхточным методам исследования относят тесты ИФА и РПГА. С их помощью проводят экспресс-диагностирование. Лаборанты делают огромное количество таких анализов. Благодаря им удается установить точный диагноз.

РПГА анализ на сифилис положителен через 30 дней после проникновения возбудителя в организм. С его помощью диагностируют первичную инфекцию, когда появляются язвы и сыпь.

Благодаря ему удается выявить запущенные, скрытно текущие, а также врожденные формы патологии. Но проводят его совместно с нетрепонемными и трепонемными тестами. Комплексное диагностирование гарантирует достоверность результатов. Тройное тестирование точно доказывает наличие или отсутствие венерической инфекции.

Положительная реакция сохраняется на протяжении большого отрезка времени. По этой причине исследование не используют для оценки эффективности лечения.

ИФА анализ положителен спустя 21 день с момента заражения. Тест иногда дает ошибочные результаты. Они появляются при системных патологиях, нарушенных обменных процессах. Их результативность сомнительна у ребенка, родившегося от инфицированной матери.

Погрешности, получаемые при серологических способах исследования, стали причиной открытия прогрессивных методик диагностики. Газовая хроматография и масс-спектрометрия не дают ложных результатов. Единственное препятствие для их массового использования – дороговизна.

Алгоритм диагностирования

• При нахождении сифилиса в первичной фазе (до 60 дней с момента инфицирования), возбудителя отыскивают на темном фоне или используют для их обнаружения флюоресцирующие антитела.
• Если патология находится в первичной, вторичной или скрытой форме применяют РМП и ИФА. Подтвердить результаты помогает РПГА анализ крови на сифилис.
• При рецидивах вторичной инфекции анализируют отделяемое изъязвлений и высыпаний. Из образцов извлекают возбудителей, изучают их с помощью микроскопии.
• Когда заболевание входит в третичную фазу, у 1/3 пациентов РМП отрицательная. При этом результаты ИФА и РПГА положительны. Однако они не всегда указывают на третичный период, а подтверждают, что человек раньше перенес инфекцию. Слабоположительный тест – доказательство полного излечения, а не развития третичной фазы.
• Подтверждая врожденный сифилис, анализ крови берут у матери и младенца. Сравнивают данные тестов РМП. Учитывают то, что у малыша ИФА и РПГА положительны. Подтверждают диагноз, используя методику иммуноблоттинга.

Сифилис, как любая системная патология, поражает весь организм. Поэтому обследование на него проходят при беременности, перед абортом. Пациенткам делают РМП, ИФА, РПГА.

Как сдать анализ

Отправляет пациентов на анализ врач-венеролог. Частные лаборатории делают анонимные исследования на сифилис по желанию клиента. Для сдачи теста в них не нужно направление врача.

Правила проведения исследования:

• Кровь в лаборатории берут утром на пустой желудок (едят после процедуры). До анализа разрешено пить только воду.
• За 2 суток до обследования запрещено: питаться жирной едой и употреблять спиртное.
• Кровь берут из пальца или вены.
• Сколько длится исследование? Обычно не больше суток. Расшифровку анализов на сифилис получают у лаборантов либо лечащего врача.
• Сколько действителен тест? По прошествии 3 месяцев результаты анализов теряют силу. Их сдают снова.

Если расшифровка анализа показывает, что тест положителен, необходимо посетить венеролога, который назначит дополнительное обследование для точного подтверждения диагноза и подберет схему необходимого лечения.

Тестирование спинномозгового содержимого

Диагноз нейросифилис ставят после того, как исследуют ликвор. Такой анализ делают:

• людям со скрытой формой инфекции;
• при симптомах заболеваний нервной системы;
• бессимптомном, запущенном нейросифилисе;
• выздоровевшим больным с положительными серологическими реакциями.

Направление на исследование ликвора дает врач. Из спинномозгового канала берут пункцию в 2 пробирки. Прокол смазывают йодом, закрывают стерильной салфеткой. После процедуры пациент соблюдает постельный режим на протяжении 2 дней.

В 1 образце определяют количество белка, клеток, следы менингита. Во второй пробе вычисляют антитела к возбудителю сифилиса. Для этого делают тесты: РВ, РМП, РИФ и РИБТ.

В зависимости от того сколько выявлено нарушений, различают 4 разновидности ликвора. Каждая указывает на определенные повреждения нервной системы. Врач диагностирует:

Помимо того, по результатам тестов судят о выздоровлении пациента.

Интерпретация тестов – задача врача. Только он способен сделать правильные выводы, при необходимости назначить дополнительное обследование, поставить точный диагноз. Не стоит делать самостоятельную диагностику при опасной системной патологии. Ошибка в диагнозе влечет за собой серьезные последствия.

Реакция связывания комплемента (РСК)

Реакция связывания комплемента (РСК) ставится в две фазы: в первой фазе антиген соединяют с исследуемой сывороткой, в которой предполагают наличие антител и добавляют комплемент, инкубируют в термостате 30 минут.

Вторая фаза: добавляют гемолитическую систему (эритроциты барана +гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате в течение 30 минут учитывают результат.

При положительной РСК антитела сыворотки, соединившись с антигеном, образуют иммунный комплекс, который присоединяет к себе комплемент, и гемолиза не произойдет. Если реакция отрицательная (антител в исследуемой сыворотки нет) - комплемент останется свободным и произойдет гемолиз.

РСК применяется для серологической диагностики сифилиса, гонорее, сыпного тифа и других заболеваний.

Реакции иммунитета с использованием меченых антигенов и антител основаны на том, что один из ингредиентов, участвующих в реакции (антигены или антитела) соединяют с какой-либо меткой, которую легко можно обнаружить. В качестве метки используют флюорохромы (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электроноплотные соединения (ИЭМ).

Иммуноферментный анализ (ИФА), как и другие реакции иммунитета, используется: 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворотке крови с помощью известного антигена. Особенность реакции в том, что известный ингредиент реакции соединён с ферментом (например, пероксидазой). Присутствие фермента определяют с помощью субстрата, который при действии фермента окрашивается. Наиболее широко применяется твёрдофазный ИФА.

1) Обнаружение антигена. Первый этап - адсорбция специфических антител на твёрдой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей. Второй этап - добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого лунки промывают. Третий этап - добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченые ферментом. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, если в исследуемом материале имеются антигены, на поверхности твёрдой фазы образуется комплекс антитела - антиген - антитела, меченые ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилендиамин в смеси с Н 2 О 2 в буферном растворе. Под действием фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску.

2) Обнаружение антител. Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках лунок. Обычно в коммерческих тест-системах антигены уже адсорбированы на поверхности лунок. Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитело. Третий этап - после отмывания в лунки добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против человеческих глобулинов), меченые ферментом. Результаты реакции оценивают, как указано выше.

В качестве контролей используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные, которые имеются в коммерческих системах.

ИФА применяется для диагностики многих инфекционных заболеваниях, в частности, ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов.

Иммуноблоттинг - это разновидность ИФА (сочетание электрофореза и ИФА). Методом электрофореза в геле разделяют биополимеры, например, антигены вируса иммунодефицита человека. Затем переносят разделённые молекулы на поверхность нитроцеллюлозы в том же порядке, в каком они находились в геле. Процесс переноса называется блоттинг, а полученный отпечаток - блот (англ. blot - пятно). На этот отпечаток действуют исследуемой сывороткой. Затем добавляют сыворотку против глобулинов человека, меченую пероксидазой, затем субстрат, который под действием фермента приобретает коричневый цвет. Образуются коричневые полосы в тех местах, где антитела соединились с антигенами. Метод позволяет обнаружить антитела к отдельным антигенам вируса.

Радиоиммунный анализ (РИА). Метод позволяет определить количество антигена в исследуемой пробе. Сначала к иммунной сыворотке присоединяют материал, предположительно содержащий антиген, затем - известный антиген, меченный радиоизотопом, например I 125 . В результате происходит связывание определяемого (немеченого) и известного меченого антигена с ограниченным количеством антител. Так как меченый антиген добавляется в определённой дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая осталась свободной из-за конкуренции с немеченым антигеном и была удалена. Количество меченого антигена, связавшегося с антителами, определяют с помощью счётчика. Оно обратно пропорционально количеству определяемого антигена.

Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ). К антигену, например, к вирусу гриппа, присоединяется специфическая антисыворотка, меченая электроноплотным веществом. В качестве метки применяют металлосодержащие белки (ферритин, гемоцианин) или коллоидное золото. При микроскопии в электронном микроскопе делают фотографии, на которых видны вирионы гриппа с присоединившимися к ним тёмными точками - молекулами меченых антител.

Приобретённый иммунитет, отличие его от наследственного (видового, врождённого). Виды приобретённого иммунитета.

Задача. В семье заболел дифтерией ребенок Валерий, трёх лет. Другие члены семьи не заболели, причём мать переболела дифтерией в детстве, а отец был привит дифтерийным анатоксином. Старшая сестра Наташа, пяти лет, в своё время не была привита дифтерийным анатоксином из-за медицинских противопоказаний, поэтому пришлось провести ей экстренную профилактику с помощью противодифтерийной антитоксической сыворотки. Младший брат, Виталий, трёх месяцев, не заболел, хотя ничем не был привит. В доме есть кошка и собака, они не заболели. Назовите для каждого из членов семьи и для животных вид иммунитета, благодаря которому они не заболели.

Что такое антиген? Какие вещества могут быть антигенами? Полноценные антигены и гаптены, чем они отличаются друг от друга? Структура антигена. Как называется часть молекулы антигена, определяющая его специфичность? Назовите известные Вам антигены. Что такое аутоантигены? Антигенное строение микробной клетки. Жгутиковые и соматические антигены; локализация, буквенное обозначение, химическая природа, отношение к температуре, способ получения, практическое применение. Анатоксин, его свойства, применение, получение. Какая ткань составляет иммунную систему организма? Укажите центральные и периферические органы иммунной системы человека. Опишите процесс формирования гуморального и клеточного иммунного ответа. Укажите клетки, которые осуществляют захват и переваривание антигена; клетки, которые взаимодействуют при формировании гуморального иммунитета, клеточного иммунитета; клетки, которые трансформируются и превращаются в плазмоциты, продуцирующие антитела; клетки, стимулирующие этот процесс; клетки, которые угнетают иммунный ответ; клетки, которые убивают опухолевые клетки, и заражённые вирусом клетки. Что такое антитела? Как получить иммунную сыворотку? Как получить сыворотку, которая бы нейтрализовала столбнячный токсин? Против каких антигенов образуются антитоксины, агглютинины, гемолизины? Какие антитела образуются при введении в организм дифтерийного анатоксина? дифтерийных бактерий? Химическая природа и структура антител. Что такое активный центр иммуноглобулина? Перечислите классы иммуноглобулинов, их свойства. Укажите класс иммуноглобулинов, способных проникать через плаценту. К какому классу относятся секреторные иммуноглобулины? Динамика накопления антител. Чем отличается вторичный иммунный ответ от первичного? Как в практической медицине используются знания о динамике иммунного ответа? Что такое реакции иммунитета, каков их механизм, фазы реакции. В каких 2-х направлениях используют реакции иммунитета? Перечислите реакции иммунитета.

Задача. Поставьте вместо пропущенных слов «анатоксин» или «антитоксин»: _________ является антигеном, _________ является антителом, __________ создаёт при введении в организм активный иммунитет, __________ создаёт при введении в организм пассивный иммунитет, __________ получают путём иммунизации животных, ___________ получают из токсина при воздействии формалином и теплом, ___________ нейтрализует токсины, __________ вызывает в организме образование антител.

Реакция агглютинации: что такое агглютинация, что является антигеном, что - антителом; методы постановки, какие контроли ставятся и для чего; как должны выглядеть контроли. Агглютинирующие сыворотки, что они содержат, как их получают, для чего применяются; что такое титр агглютинирующей сыворотки? Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации: что служит антигеном в этой реакции, как его получают, механизм реакции. Что такое эритроцитарный диагностикум? Что такое антительный эритроцитарный диагностикум? Реакции преципитации: что такое преципитация, что служит антигеном; как получить преципитирующую сыворотку? Что такое титр преципитирующей сыворотки? Методы постановки, практическое применение.

Реакция связывания комплемента (РСК): принцип РСК; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии? Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает - положительный или отрицательный результат? Методика постановки РСК. Почему исследуемую сыворотку надо инактивировать? Гемолитическая сыворотка: что содержит, как ее получают, что такое титр и как его определяют? Комплемент: химическая природа, отношение к высокой температуре, где содержится? Как можно разрушить комплемент? Что практически применяется в качестве комплемента?

Задача. На одежде человека, обвиняемого в убийстве, обнаружено пятно крови. С помощью какой реакции можно определить, человеческая ли это кровь; что в этой реакции будет антигеном, и что антителами; какой диагностический препарат нужно иметь в лаборатории для этой реакции, как его приготовляют?

Задача. Как при помощи реакции преципитации определить, является ли доставленный для анализа образец мяса крупного рогатого скота или мясом лошади; какие необходимы диагностические препараты?

Реакция преципитации в агаровом геле, способы постановки, практическое применение.

Что показывает серологический анализ крови?

Что показывает серологический анализ крови? Диагностические мероприятия – это важнейший этап в терапии любого заболевания. Успех лечения зависит не только от назначенных препаратов, но и во многом от того, насколько правильно был поставлен диагноз.

Кроме того, диагностика позволяет предотвратить осложнения и сопутствующие заболевания. С помощью серологического анализа крови пациента выявляют наличие антител и антигенов. Исследование помогает найти множество заболеваний, определить их фазу и контролировать прохождение лечения.

Что такое серология?

Серологией называется отрасль иммунологии, изучающая реакции антигенов на антитела. Данный раздел медицины занимается изучением плазмы крови и ее иммунологических характеристик.

На сегодняшний день серологический анализ крови на антитела – это надежный способ выявления вируса иммунодефицита человека, гепатита, бруцеллеза, ЗППП и других опасных для жизни заболеваний. Разберемся, в каких случаях его назначают.

Показания к назначению

Серологический анализ крови необходим для выявления возбудителя болезни при затруднениях в постановке диагноза.

Для проведения этой реакции в плазму вводят антигены возбудителей, а затем протекающий процесс изучает лаборант. Либо осуществляют обратную реакцию: в инфицированную кровь вводят антитела для определения конкретной принадлежности возбудителя.

Сфера применения

Данное исследование используют в различных отраслях медицины. С помощью этой реакции выявляют специфические клетки и антитела, вырабатываемые организмом для того, чтобы бороться с инфекциями и вирусами.

Кроме этого, с помощью серологического метода определяется группа крови человека.

Подобное серологическое исследование анализа крови используют в гинекологии для диагностики болезней, передаваемых половым путем. Практикуется такой метод и для комплексных обследований беременных женщин (выявление токсоплазмоза, ВИЧ, сифилиса и т. д.). Прохождение этого теста является обязательным при постановке на учет в женской консультации.

У детей серологическая реакция используется для подтверждения диагноза так называемых «детских» заболеваний (ветрянки, кори, краснухи и т. д.) в том случае, если симптоматика не имеет выраженных проявлений и невозможно выявить болезнь, анализируя клинические показания.

Выявление венерических заболеваний

Для венерологов это тестирование поистине незаменимо и позволяет поставить диагноз очень точно.

При смазанной клинической картине серологический анализ крови на сифилис, лямблиоз, уреаплазмоз, хламидиоз, герпес и другие заболевания позволяет быстро выявить наличие антител.

Вирусные и инфекционные заболевания

Серологический анализ активно используется гастроэнтерологами, гепатологами и инфекционистами для диагностики вирусного гепатита.

Расшифровка серологического анализа крови дает возможность определить стадию протекания заболевания и ответить на вопрос, насколько необходима госпитализация в данный момент. Как правильно подготовиться?

Подготовка к сдаче анализа

Серологический анализ крови делают и в государственных, и в коммерческих клиниках. Предпочтение стоит отдать лаборатории, располагающей современным оборудованием и квалифицированным персоналом.

Биологическими образцами для исследования могут быть слюна и кал, но в большинстве случаев используется венозная кровь больного. Кровь для серологического теста берут из локтевой вены в условиях лаборатории. Перед тем как сдавать анализ, следует проконсультироваться с врачом по поводу подготовки к этой процедуре.

Для подготовки к сдаче анализа на серологическое исследование нужно соблюсти несколько несложных правил.

Кровь сдают в спокойном состоянии до приема пищи, то есть натощак. Перед этим не следует проходить другие исследования, например делать рентген, УЗИ и т. д.

Нужно исключить прием антибактериальных и некоторых других препаратов за несколько недель до сдачи крови. Определенные рекомендации в этом случае зависят от того заболевания, на которое делается тест. К примеру, исследование на гепатит предполагает исключение жирной пищи и алкоголя за 48 часов до процедуры.

Реакция флюоресценции

Среди разновидностей серологических реакций существует реакция флюоресценции. По этой методике используется реагент, подсвечивающий антитела в сыворотке крови.

Постановка серологической реакции прямого типа предполагает маркировку специфических антител флюоресцирующим веществом. Такая реакция является самой быстрой и проводится одноэтапно.

Другой вариант проведения такого анализа имеет название непрямого, или РНИФ. Проводится он в два этапа. На первом этапе антитела не маркируются флюоресцирующими метками, а на втором применяются соответственно отмеченные антитела для определения антигенов и антител. Свечение возникает только после того, как происходит связывание со специфическим антителом.

Что же показывает серологический анализ крови? Итог всей процедуры оценивает специальный прибор, который анализирует силу излучения, выявляет форму и размер исследуемого объекта. Возбудители инфекционных заболеваний выявляются с результатом, достоверность которого составляет%, в зависимости от вида и стадии патологии.

Иммуноферментный анализ

В этих видах серологического исследования применяются уникальные стабильные реагенты. Отмеченные вещества как бы приклеиваются к искомым антителам. В итоге мы получаем качественный или количественный результат.

Если выраженных маркеров не обнаружилось, то результат будет считаться отрицательным. Если присутствие антител в биологических образцах при качественном исследовании обнаружено, то результат анализа считается положительным. При количественном определении клеток анализ дает более точный результат.

Анализируя показатели анализа (например, сумму выявленных клеток) специалист определяет, находится ли заболевание на начальном этапе, в острой стадии, или это обострилась хроническая форма патологии. Для того чтобы поставить диагноз, врач учитывает не только данные серологического исследования, но и клиническую картину заболевания.

Особенности данного теста

Проведение данного анализа не всегда способно дать 100%-ную уверенность в том, что определенное заболевание обнаружено. Бывает так, что результаты могут быть неоднозначными и требуется проведение других процедур.

Например, во время исследования на бруцеллез сыворотка крови проходит контроль на самозадержку без антигена. Это существенно повышает достоверность тестирования. Анализ на бруцеллез может иметь положительное или отрицательное значение, а также вызывать сомнения.

При получении сомнительных результатов, не имеющих однозначной трактовки, рекомендовано сдать анализ повторно. Кроме того, бруцеллез можно выявить в результате посевов крови, исследовав костный мозг и спинно-мозговую жидкость.

Плюсы серологического анализа крови

Диагностические методики с использованием серологических реакций обширно используются в современной медицинской практике. Особенно часто это делается при определении вирусных и инфекционных патологий.

Эти же анализы применяются при проведении географического скрининга и медицинского обследования с целью предупреждения эпидемиологического распространения инфекции.

К достоинствам метода можно отнести:

• Высокий уровень достоверности.
• Быстрое проведение реакции и получение результатов. Результаты РСК известны уже через 24 часа. При особой ситуации, в условиях стационара, анализ будет готов через несколько часов.
• Осуществление контроля развития болезни и эффективности проводимой терапии.
• Невысокая стоимость и доступность для пациентов.

Минусы метода

Однако серологические исследования имеют и свои недостатки.

К ним относится тот факт, что при проведении анализа следует учитывать инкубационный период заболевания, для того чтобы получить более достоверную картину.

К примеру, определение простого герпеса первого или второго типа возможно лишь спустя 14 дней с момента заражения. Анализ на наличие вируса иммунодефицита проводят через 30 дней, через 90 дней и спустя полгода после контакта с инфицированным человеком.

Безусловно, на достоверность результатов может оказывать влияние и человеческий фактор: пренебрежение правилами подготовки к забору крови или ошибка, допущенная лаборантом при проведении реакции.

По статистике, ошибочный результат может быть получен в 5 % случаев. Опытный врач при обследовании пациента, изучив клиническую картину, в большинстве случаев может вычислить допущенную ошибку.

Какие анализы крови сдают на сифилис: RW, РПГА, ИФА, VDRL, RPR, РИБТ, расшифровка результатов тестов

Сифилис – заболевание инфекционной природы, обусловленное спирохетой Treponema pallidum, склонное к прогредиентному хроническому течению, с чёткой периодизацией клинической симптоматики.

Преобладание полового пути передачи над контактным и трансплацентарным ставит это заболевание в ряд венерических (ЗППП, ИППП). Помимо указанных способов передачи инфекции особую роль играет артифициальный путь (от лат. «artificio» - искусственно созданный).

Он характерен для медицинских учреждений, в основном, реализуется в условиях стационара. Инфицирование происходит при гемотрансфузиях, различных хирургических операциях, инвазивных диагностических методах.

Несмотря на карантинизацию донорской крови, проблема выявления сифилиса у доноров на разных стадиях заболевания все ещё актуальна.

Поэтому диагностические мероприятия при сифилисе требуют стандартизации, внедрения новых чувствительных и информативных методов идентификации, а также сведения к минимуму ошибок и неправильной трактовки результатов анализов.

Классификация методов лабораторной диагностики

Диагностика сифилиса имеет некоторые особенности и отличается от диагностики других бактериальных инфекций. Сложное строение и антигенные свойства бледной трепонемы обусловливают ошибки в интерпретации результатов серологических реакций.

Сдать анализ крови на сифилис предлагают 3 основным группам пациентов:

1. 1 Скрининг и диспансеризация групп населения (в том числе и беременность, постановка на учет в женской консультации, поступление на работу и оформление медкнижки и так далее).
2. 2 Скрининг в группах риска (незащищенные половые контакты с человеком, инфицированным сифилисом, лица после принудительных сексуальных контактов, ВИЧ-инфицированные и так далее).
3. 3 Лица, имеющие симптомы заболевания, или лица с подозрением на сифилитическую инфекцию.

Все лабораторные методы условно подразделяют на прямые и непрямые.

Прямые методы

1. 1 Идентификация Treponema pallidum в тёмном поле (темнопольная микроскопия).
2. 2 Заражение подопытных животных (культивирование в лабораторных животных).
3. 3 ПЦР (полимеразно-цепная реакция).
4. 4 ДНК-зонд или гибридизация нуклеиновых кислот.

Непрямые методы

Серологические реакции - это методы лабораторной диагностики, базирующиеся на обнаружении антител (сокращенно АТ) к антигенам бледной трепонемы (сокращенно АГ). Они имеют основное значение для подтверждения диагноза.

1. 1 Нетрепонемные тесты:
   • Реакция Вассермана (РСК);
   • Реакция микропреципитации (МР, РМП) и ее аналоги, которые приведены ниже;
   • Тест быстрых плазменных реагинов (RPR, РПР);
   • Тест с красным толуидином и сывороткой (TRUST);
   • Нетрепонемный тест Лаборатории исследования венерических болезней - VDRL.
2. 2 Трепонемные тесты:
   • Р-ция иммобилизации Treponema pallidum – РИБТ/РИТ;
   • Р-ция иммунофлюоресценции – РИФ, FTA (разведения сывороток РИФ-10, РИФ-200, РИФ-абс);
   • Р-ция пассивной гемагглютинации (РПГА, ТРПГА, TPHA);
   • Иммуноферментный анализ (ИФА, EIA);
   • Иммуноблоттинг.

Рисунок 1 - Алгоритм серодиагностики сифилиса

Гистоморфологические методы

Эти методы сводятся к выявлению особенностей гистоморфологии сифилитических проявлений. Внимание уделяется тонкостям строения твёрдого шанкра. Однако, дифференциальная диагностика инфекции с помощью гистологии весьма затруднительна. Гистоморфология используется с другими лабораторными и клиническими тестами.

Микроскопия Treponema pallidum в тёмном поле

Этот метод основывается на непосредственном обнаружении бледной трепонемы в исследуемом материале с помощью микроскопа и специальных приспособлений (чаще всего отделяемое эрозий и язв, реже спинномозговая жидкость и другие субстраты).

С помощью скарификации, соскоба, сдавливания с эрозий и язвенных дефектов получают экссудат, затем исследуют в микроскоп подготовленный препарат.

Обычно бледные трепонемы выявляют в препарате, полученном из шанкра, из очагов вторичного свежего, вторичного рецидивного сифилиса, а также пунктата лимфоузлов, плаценты.

Основанный на феномене свечения мелких частиц в тёмном поле при попадании луча света (феномен Тиндаля), метод прекрасно позволяет дифференцировать возбудителя сифилиса от других трепонем на основании морфологических отличий и отличий в способах передвижения бактерии.

Для микроскопии используют специальный темнопольный конденсор соответствующего оптического разрешения. Препарат получают способом раздавленной капли (каплю материала наносят на чистое обезжиренное предметное стекло и закрывают очень тонким покровным).

На покровное стекло капают иммерсионное масло. С помощью поворота тубуса и поворота увеличивающей линзы регулируют нужное освещение.

В тёмном поле микроскопа обнаруживаются клетки крови, эпителиальные клетки и сам возбудитель сифилиса. Бледная трепонема выглядит как спираль, очень тонкая, излучающая серебристый цвет, с плавными движениями.

Рисунок 2 - Темнопольная микроскопия как способ визуализации бледной трепонемы в исследуемом материале. Источник иллюстрации - CDC

Treponema pallidum необходимо отличать от других трепонем, в том числе и Tr. refringens, которая может содержаться в ротоглотке и на слизистой половых органов. Эта бактерия совершает хаотичные движения, имеет широкие и несимметричные, довольно грубые завитки. Кроме того, Treponema pallidum отличают от Tr. Microdentium, Tr. Buccalis и Tr. vincenti.

Визуализация бактерий в тёмном поле иногда дополняется реакцией флюоресценции. Для этого меченые флюоресцирующим красителем противотрепонемные АТ добавляют в нативный материал. При этом образуется комплекс, называемый антиген-антитело (сокращенно АГ-АТ), который и является объектом для исследования с помощью люминесцентного микроскопа.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ПЦР, разработанная в 1991 году для обнаружения молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) бледной трепонемы, является высокочувствительным и специфичным, позволяет выявить фрагменты ДНК возбудителя.

Базируется данный анализ на копировании коротких участков ДНК бледной спирохеты, который удовлетворяет заданным параметрам и присутствует в образце. Всё это выполняется в искусственных условиях (in vitro). Реакция проводится в приборе - амплификаторе, который обеспечивает периодизацию температурных циклов. Происходит охлаждение с последующим нагреванием пробирок с погрешностью в 0,1˚С.

ДНК-матрицу прогревают в течение 2 минут при температуре 92-98˚С (максимальная температура используется, если полимераза термостабильна). При нагревании цепи ДНК расходятся из-за распада водородных связей между ними. В стадии отжига температуру реакции снижают для связывания праймера с одноцепочечной матрицей.

Отжиг занимает около 30 секунд, в течение этого времени синтезируются сотни нуклеотидов. Вновь синтезируемые молекулы копируются полимеразой, в результате многократно увеличиваются специфические фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты. Последующая детекция фрагментов проводится с помощью электрофореза в геле агар.

ПЦР-диагностика сифилиса пока носит экспериментальный характер, но оправдана при выявлении врождённой инфекции, в сложных диагностических случаях или при минимальном содержании бледных трепонем в исследуемом материале.

ДНК-гибридизация

ДНК-гибридизация выполняется in vitro и основана на полном или частичном соединении двух одноцепочечных молекул ДНК в одну молекулу. В случае полного соответствия комплементарных фрагментов объединение происходит легко. Если комплементарное соответствие частичное, то объединение цепочек ДНК происходит медленно. На основании времени слияния цепей можно оценить степень комплементарности.

При нагреве ДНК в буферном растворе разрываются водородные связи азотистыми основаниями, являющимися комплементарными, в результате цепочки ДНК расходятся. Далее получают препарат из двух денатурированных дезоксирибонуклеиновых кислот. При охлаждении одноцепочечные участки ренатурируют. Образуется так называемый гибрид ДНК.

Метод позволяет оценить и анализировать скорость отжига, учитывая особенности (сходства и различия) ДНК между видами или внутри вида.

Применение ДНК-зонда заключается в гибридизации меченого фрагмента ДНК со специфичным участком ДНК для идентификации комплементарных последовательностей нуклеотидов. Для метки зонда используется группа ненасыщенных атомов (хромофоры) или радиоактивные изотопы.

ДНК–зонд применяют для гетерогенного и гомогенного детектирования нуклеиновых кислот. Роль зонда заключается в определении участков, на которых произошло слияние мишень-зонд. Детектирование в гомогенной системе имеет преимущество - позволяет отследить гибридизацию молекул ДНК в реальном времени.

Суть метода сводится в денатурации ДНК и ренатурации (воссоединения цепочек ДНК). Процесс ренатурации нуклеиновой кислоты и ДНК-зонда заканчивается образованием «гибрида».

Специфические последовательности нуклеиновых кислот гибридизуются с ДНК–зондом и, таким образом, выявляются и позволяют оценить количество ДНК в исследуемом материале.

Заражение лабораторных животных

Высокая чувствительность кроликов к Treponema pallidum (порядка 99,9%) позволяет применять их в диагностике сифилитической инфекции.

Заражение кроликов проводится в научно-исследовательских центрах и является «золотым стандартом» оценки чувствительности других методов.

Вернёмся к трепонемным и нетрепонемным тестам, так как они используются чаще всего. Рассмотрим их преимущества и недостатки, а также ошибки в интерпретации результатов.

Нетрепонемные тесты

Это тесты определения антител IgG и IgM к стандартизированному кардиолипиновому антигену. Их существенным недостатком является сравнительно небольшая специфичность.

Низкая стоимость и простота выполнения позволяют отнести эти тесты к отборочным диагностическим, необходимым для установки предварительного диагноза и скрининга среди населения.

Именно нетрепонемные тесты сдаются при оформлении медицинской книжки, устройстве на работу, постановке на учет в женской консультации.

1. 1 Минимальная чувствительность в стадии сифилиса первичного – 70%;
2. 2 Минимальная чувствительность в стадии сифилиса позднего – 30%;
3. 3 Возможность появления ложноотрицательных и ложноположительных результатов;
4. 4 Трудоёмкость выполнения РСК.

1. 1 Относительно маленькая стоимость производства тестов;
2. 2 Получение быстрого ответа;
3. 3 Возможность их применения для скрининга.

Получение ложноположительных или слабоположительных проб возможно в следующих случаях:

1. 1 Нарушение технологии выполнения, при блокировании комплекса АГ-АТ.
2. 2 Наличие у больного аутоиммунных заболеваний (ревматоидный артирит, ревматизм, склеродермия, системная красная волчанка, саркоидоз и др.).
3. 3 Злокачественные новообразования.
4. 4 Вирусные и бактериальные инфекции.
5. 5 Эндокринные заболевания (аутоиммунный тиреоидит, сахарный диабет).
6. 6 Беременность.
7. 7 Употребление алкоголя.
8. 8 Приём жирной пищи.
9. 9 Старческий возраст.

Как видно из списка, существует достаточно причин для неверного результата. Поэтому к нему следует весьма настороженно относиться. Рассмотрим наряду с РСК ещё две пробы. Это реакция микропреципитации и VDLR (ее модификация).

Реакция связывания комплемента (РСК, Вассермана, RW)

Это проба, основанная на способности комплемента связываться с комплексами АГ-АТ. Идентифицируют образовавшийся комплекс с помощью гемолитической системы. Кардиолипиновый антиген заметно повышает чувствительность пробы.

Чувствительной является и реакция Колмера, которая заключается в выполнении при различных температурных режимах. Так, первая фаза реакции Колмера протекает при температуре 20˚С в течение получаса, вторая фаза при тепературе 4-8˚С на протяжении 20-ти часов. За это время происходит связывание комплемента.

При выполнении РСК возможно получение резко положительных результатов. Причиной, вероятно, является большой титр антител в неразведенной сыворотке. В этом случае пробы ставят с уменьшающими дозами.

Для дифференцировки стадий сифилиса и оценки эффективности противосифилитического лечения определяют количество АТ в сыворотке.

Позитивность пробы оценивают с помощью крестов, также в реакциях Вассермана, Колмера и Канна указывается разведение сыворотки.

Реакция микропреципитации

Так как трудоёмкость выполнения вышеуказанных проб велика, то для широты обхвата диспансеризацией разных групп населения разработан ускоренный способ серодиагностики сифилиса, так называемый экспресс-метод – реакция микропреципитации (сокращенно МР, РМП).

Она выполняется с кардиолипиновым антигеном и вспомогательными веществами. Его преимуществом является забор периферической крови для исследования. Это значительно ускоряет и саму методику, и работу лаборантов.

Рисунок 2 - Реакция микропреципитации (схема)

Для проведения МР необходимы плазма или инактивированная сыворотка крови пациента (именно они содержат антитела). Далее плазму помещают в маркированные лунки. Затем, к исследуемому материалу добавляют каплю кардиолипинового антигена, смешивают и встряхивают. В итоге в сыворотке инфицированного появляются характерные хлопья, разные по степени интенсивности.

Это качественная проба. При количественной оценке используются 10 разведений сыворотки, помещаемой в 10 лунок с соответствующей маркировкой. При качественной МР ответ указывается в виде крестов (плюсов) или минуса, при количественной указывается титр антител (1:2, 1:4 и так далее).

Наличие хлопьев расценивается как положительный или слабоположительный ответ. Возможно появление флокулята и при отсутствии заболевания, поэтому окончательную оценку полученного результата проводят после контрольного исследования или проведения других реакций (РИБТ, РИФ, ИФА, РПГА).

Рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения метод постановки реакции с антигеном липоидной природы (АГ) по праву считается лучшим среди других стандартных нетрепонемных тестов. Разработан в США, штате Джорджиа в лаборатории венерических болезней (Veneral Diseases Research Laboratories).

Аббревиатура учреждения послужила названием для пробы – VDRL. VDRL - это модификация МР. Сыворотку от больного сифилисом инактивируют и помещают на предметное стекло. Используемый антиген состоит из кардиолипина, холестерина и лецитина в разном процентном соотношении. Ответ регистрируется практически сразу.

Отчётливая флокуляция возникает в присутствии в сыворотке антител. Сыворотка становится реактивна по прошествии 4-х недель после заражения. Для оценки количества антител, сыворотку предварительно разводят в геометрической прогрессии.

1. 1 сравнительно высокая чувствительность;
2. 2 сравнительно высокая специфичность;
3. 3 легкость выполнения;
4. 4 малая стоимость реактивов;
5. 5 получение быстрого ответа.

Недостатком VDRL является относительно высокая частота ложноположительных результатов.

Их причинами являются всё те же перечисленные выше заболевания.

Трепонемные тесты исполняются со специфическими АГ Treponema pallidum. Они необходимы и обязательны для установления окончательного диагноза. Это реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакции непрямой гемагглютинации (РПГА), иммуноферментный анализ (ИФА) и др.

После положительного результата нетрепонемного теста (RPR, MP, VDRL) всегда должны выполняться трепонемные (чаще комбинация - РПГА, ИФА, РИФ).

Трепонемные тесты более сложны в исполнении, чем экспресс-тесты, и требуют больших затрат денежных средств.

Данная реакция (сокращенно РИФ) используется для диагностики сифилиса, в том числе и скрытых форм, и перепроверки положительных и ложноположительных проб.

РИФ основана на свечении меченых антител при соединении с комплексом антиген-антитело под кварцевой лампой. Метод начал применяться в 60-х годах и отличался простотой выполнения и высокой специфичностью (которая немного уступает РИБТ).

Он имеет несколько модификаций: РИФ-10, РИФ-200 и РИФ-abs.

Наиболее чувствительна РИФ в разведении 10 раз, а остальные - более специфичны. РИФ проводится в двух фазах. К АГ добавляют сыворотку крови пациента. Образуется комплекс АГ-АТ, который исследуется в следующей фазе. Далее меченный с помощью флюоохрома комплекс идентифицируют при микроскопии. Если не наблюдается свечение, это указывает на отсутствие специфических АТ в сыворотке крови.

РИФ-200 является наиболее ценным из всех разведений. Метод предназначен для диагностики различных форм сифилиса, особенно скрытого сифилиса и перепроверки положительных проб.

Реакция иммобилизации бледных трепонем (сокращено РИБТ, РИТ) одна из сложных серологических проб, требующих значительных усилий и финансовых затрат. РИБТ применяют все реже, но актуальность ее сохраняется в диагностике скрытого сифилиса.

Большое значение она несёт в распознавании ложноположительных результатов у беременных женщин и основывается на иммобилизации бактерий в присутствии иммобилизинов – поздних антител.

Результат оценивается на процентном количестве (%) иммобилизированных трепонем с помощью специальной таблицы:

1. 1 От 0 до 20 - отрицательная проба.
2. 2 От 21 до 50 - слабоположительная проба.
3. 3 От 50 доположительная реакция.

Ложноположительные результаты также возможны при применении РИБТ. Так, неверный ответ возможен при инфицировании тропическими трепанематозами, а также, при туберкулёзе, циррозе печени, саркоидозе и пациентов старческого возраста.

Этот анализ крови на сифилис называется реакцией пассивной гемагглютинации (сокращенно, кровь на РПГА, ТРПГА).

Антиген для РПГА приготавливают из эритроцитов барана, покрытых фрагментами бледных трепонем (полученных от инфицированных кроликов (см. рисунок 4)). Для анализа используется венозная кровь (плазма или инактивированная сыворотка) пациента.

При добавлении антигена в сыворотку пациента с сифилисом происходит образование комплекса АГ-АТ, который приводит к агглютинации эритроцитов. агглютинация определяется субъективно врачом-лаборантом.

Рисунок 3 - Схема РПГА (реакция пассивной гемагглютинации)

Проба оценивается как положительная при появлении агглютинатов равномерной розовой окраски. Окрашивание преципитата в красный свидетельствует об осаждении эритроцитов. РПГА является высокочувствительной и высокоспецифичной.

Реакция микрогемагглютинации

Она является упрощённым вариантом РПГА. Отличается от пробы, описанной выше, меньшим количеством антигена, разбавителя и сыворотки крови для выполнения реакции. Через 4 часа после инкубации сыворотки можно оценить пробу. Используется при скрининговых и массовых обследованиях на сифилис.

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (сокращенно ИФА) базируется на специфической реакции антиген-антитело. Биологический материал (сыворотка крови пациента, ликвор) вносят в лунки, на твердой поверхности которых фиксированы антигены бледной трепонемы. Исследуемый материал инкубируют, затем отмывают антитела, не связавшиеся с антигенами (см. рисунок 5).

Идентификация полученного комплекса осуществляется на этапе ферментации с помощью иммунной сыворотки, меченной ферментом. При химической реакции фермент окрашивает полученные комплексы. Интенсивность окрашивания зависит от количества специфических антител в крови пациента и фиксируется спектрофотометром.

Рисунок 4 - Схема ИФА (иммуноферментного анализа)

Чувствительность ИФА составляет более 95% . Метод используется в автоматизированном режиме для исследования декретируемых групп населения: доноров, беременных и других, для уточнения диагноза при положительных и ложноположительных нетрепонемных тестах.

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг – высокочувствительный метод, модификация простого ИФА. Реакция основана на электрофорезе с разделением антигенов бледных трепонем.

Разделенные иммунодетерминанты переносят на нитроцеллюлозную бумагу и проявляют в ИФА. Далее инкубируют сыворотку и смывают не связавшиеся антитела. Полученный материал обрабатывают иммуноглобулинами (IgМ или IgG), меченными ферментом.

Клиническая оценка результатов лабораторной диагностики сифилиса

В таблице 1 ниже мы привели возможные результаты анализов и их расшифровку. Как можно видеть в таблице, основное значение при расшифровке имеет комплексная оценка тестов.

Таблица 1 - Расшифровка результатов серологических реакций (анализов крови на сифилис). Для просмотра кликните по таблице

Оценка реактивности тестов выполняется также «крестами»:

1. 1 Максимальный ответ (резко положительная проба) обозначается с помощью 4-х крестов.
2. 2 Положительная проба обозначается с помощью 3-х крестов.
3. 3 Слабоположительную реакцию обозначают двумя крестами.
4. 4 Один крест свидетельствует о сомнительном и отрицательном результате.
5. 5 Отрицательный ответ маркируют знаком «минус».

Проблема оптимизации лабораторной диагностики сифилиса не потеряла свою актуальность до настоящего времени. Современные методы диагностики, несмотря на стремление учёных привести диагностику к максимально высоким показателям чувствительности и специфичности, требуют контрольной проверки и индивидуального подхода.

Особенностью сифилитической инфекции является феномен серорезистентности, который так и не получил научного объяснения. Диагноз выставляется после полноценного обследования больного эпидемиологическими, клиническими, лабораторными методами.

На фоне экономико-технического развития медицины наблюдается и прогресс в разработке новых критериев диагностики сифилиса. Всё это позволит быстро, успешно и безошибочно лечить пациентов.