Genetika carries out scientific research in microbial and cell culture biotechnology mainly in the form of research projects requested by industry. Our results are available as patents, license and know-how. Since its foundation (1968) Genetika has been one of the most significant Russian research centers in microbial genetics and molecular biology and at the same time served as the main source of new strains and processes for Russian biotechnological industry.
Technologies developed in Genetika (threonine — 1979, riboflavin — 1991, acrylamide — 2000, phytase — 2008) are used all over the world by leading biotechnology companies. Governmental granted basic research as well as collaboration with other Russian and international research organizations helps to bridge the gap between applied and basic research. A range of interdisciplinary research projects is driving the innovative development forward. Now Genetika is ready to pursue the implementation of innovative research in industrial and social applications all around the world.more
|
New article in CELL by Genetika researchers Alex Mironov and Svetlana Eremina. Bacterial Nitric Oxide Extends the Lifespan of C. elegans (download the article) Ivan Gusarov, Laurent Gautier, Olga Smolentseva, Ilya Shamovsky, Svetlana Eremina, Alexander Mironov, Evgeny Nudler., ABSTRACT Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in multicellular organisms. Most animals produce NO from L-arginine via a family of dedicated enzymes known as NO synthases (NOSes). A rare exception is the roundworm Caenorhabditis elegans, which lacks its own NOS. However, in its natural environment, C. elegans feeds on Bacilli that possess functional NOS. Here, we demonstrate that bacterially derived NO enhances C. elegans longevity and stress resistance via a defined group of genes that function under the dual control of HSF-1 and DAF-16 transcription factors. Our work provides an example of interspecies signaling by a small molecule and illustrates the lifelong value of commensal bacteria to their host. |
 |
|
New review article "Microbial Producers of Butanol" (Download the article) O. V. Berezina, N. V. Zakharova, C. V. Yarotsky, and V. V. Zverlov Abstract—This review is written due to an increased interest in the production of energy carriers and basic substrates of the chemical industry from renewable natural resources. In this review, the microbiological aspects of biobutanol production are reflected and the microbial producers of butanol (both natural, i.e., members of the Clostridium genus, and recombinant), obtained by genetic modification of Clostridia and other microorganisms, are characterised. |
 |
Симптомы кишечной палочки. Пищевые отравления, вызванные некоторыми штаммами кишечной палочки, опасны из-за выделяемых ими токсинов. Симптомы заражения включают схваткообразные боли в животе и диарею, нередко с кровью. При отсутствии каких-либо симптомов, истинная бактериурия (инфекция мочевых путей) диагностируется при наличии не менее 105 микробных тел кишечных палочек.
Кишечная палочка (эшерихия коли , лат. escherichia coli ; общепринятое сокращение E. coli ) - вид грамотрицательных палочковидных бактерий, входящий в состав нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека.
Вид эшерихия коли (e. coli ) входит в род эшерихии (лат. escherichia ), семейство энтеробактерии (лат. enterobacteriaceae ), порядок энтеробактерии (лат. enterobacteriales ), класс гамма-протеобактерии (лат. γ proteobacteria ), тип протеобактерии (лат. proteobacteria ), царство бактерии.
Существует большое число разновидностей кишечной палочки (escherichia coli ), в том числе, более 100 патогенных («энтеровирулентных») типов, объединенных в четыре класса: энтеропатогенные, энтеротоксигенные, энтероинвазивные и энтерогеморрагические. Морфологические различия между патогенными и непатогенными эшерихиями отсутствуют.
Симптомы и признаки заражения кишечной палочки
Инфекция, обусловленная кишечной палочкой 0157: Н7, обычно начинается остро со схваткообразных абдоминальных болей и водянистой диареи, которая может сопровождаться обильной примесью крови в течение 24 часов. Некоторые пациенты описывают диарею как кровь без кала, что легло в основу термина «геморрагический колит». Лихорадка обычно отсутствует или является незначительной. Иногда спонтанно температура тела может подниматься до 39 °С. При неосложненной инфекции диарея может продолжаться 1-8 дней.
Приблизительно в 5 % случаев (в основном у детей младше 5 лет и взрослых старше 60 лет) возникает такое осложнение как гемолитикоуремический синдром, который в типичных случаях возникает на 2 неделе заболевания. Как с этим осложнением, так и без него может быть летальный исход, особенно у пожилых лиц.
Кишечная палочка в моче при беременности
Кишечная палочка в моче при беременности обнаруживается достаточно часто. Поэтому кишечная палочка становится полнейшим сюрпризом для беременной. Обычно это происходит тогда, когда анализы мочи показывают, что внутри происходит воспаление. Если в бакпосеве мочи обнаружили Escherichia coli в концентрации больше допустимой. Это означает, что концентрация бактерий превышает допустимую норму. Если даже сейчас нет
никаких симптомов, возможно развитие инфекции мочевыводящих путей. Установлено, что при наличии инфекции мочевыводящих путей увеличивается
риск преждевременных родов, плацентарной недостаточности,
преждевременного излития околоплодных вод, хориоамнионита. Происходит
рождение недоношенных или функционально незрелых детей, а также
новорожденных с задержкой внутриутробного развития и признаками
внутриутробной инфекции, одна из причин рождения детей с врожденными пороками развития,
задержкой умственного развития и детским церебральным параличом.
Кишечные палочки. Общие сведения
Кишечные палочки (escherichia coli ) устойчивы во внешней среде, длительное время сохраняются в почве, воде, фекалиях. Хорошо переносят высушивание. Кишечные палочки обладают способностью к размножению в пищевых продуктах, особенно в молоке. Быстро погибают при кипячении и воздействии дезинфицирующих средств (хлорной извести, формалина, фенола, сулемы, едкого натра и др.). Кишечные палочки более устойчивы во внешней среде по сравнению с другими энтеробактериями. Прямой солнечный свет убивает их в течение нескольких минут, температура 60°С и 1 % раствор карболовой кислоты - в течение 15 минут.Часть кишечных палочек имеет жгутики и подвижны. У других кишечных палочек жгутики и способность к движению отсутствуют.
Escherichia coli в кишечнике и кале человека
Число кишечных палочек escherichia coli среди других представителей микрофлоры кишечника не превышает 1%, но они играют важнейшую роль в функционировании желудочно-кишечного тракта. Кишечные палочки e coli являются основными конкурентами условно-патогенной микрофлоры в отношении заселения ими кишечника. Кишечные палочки e coli забирают из просвета кишечника кислород, который вреден для полезных для человека бифидо- и лактобактерий. Кишечные палочки e coli вырабатывают ряд необходимых для человека витаминов: В1, В2, В3, В5, В6, В9, B12, К, участвует в обмене холестерина, билирубина, холина, желчных и жирных кислот, оказывает влияние на всасывание железа и кальция.Escherichia coli в кишечнике человека появляются в первые дни после рождения и сохраняются на протяжении жизни на уровне 10 6 -10 8 КОЕ/г содержимого толстой кишки. В фекалиях здорового человека кишечные палочки (типичные) выявляются в количестве 10 7 -10 8 КОЕ/г, при этом количество лактозонегативных кишечных палочек не должно превышать 10 5 КОЕ/г, а гемолитические кишечные палочки должны отсутствовать.
Отклонения от указанных значений является признаком дисбактериоза:
- снижение типичных кишечных палочек до 10 5 -10 6 КОЕ/г, или повышение содержания типичных эшерихий до 10 9 -10 10 КОЕ/г определяется, как первая степень микробиологических нарушений
- повышение концентрации гемолитических кишечных палочек до до 10 5 -10 7 КОЕ/г определяется, как вторая степень микробиологических нарушений
При избыточном росте кишечной палочки, как следствии дисбактериоза, кроме бактериофагов, при медикаментозной терапии применяются различные пробиотки (Бифидумбактерин, Лактобактерин, Ацилакт, Аципол и др.) и/или адекватные конкретному штамму e. coli и причине дисбактериоза антибиотики (у взрослых).
Эшерихиозы
Патогенные серотипы кишечных палочек могут быть причиной эшерихиозов - различных инфекционных заболеваний, протекающих с интоксикацией, лихорадкой, обычно с поражением желудочно-кишечного тракта, реже - мочевыводящих, желчевыводящих путей, других органов или с развитием сепсиса. Эшерихиозы чаще встречаются у детей раннего возраста. Механизм распространения эшерихиозов ЖКТ - фекально-оральный. Чаще всего заражение происходит через загрязнённую пищу или воду.
Энтеропатогенная кишечная палочка
Энтеропатогенной кишечной палочки имеет два важных фактора вирулентности:
- фактор колонизации, за счет которых происходит прилипание ETEC к энтероцитам тонкой кишки
- токсический фактор: штаммы ETEC продуцируют термолабильные (LT) и/или термостабильные (ST) энтеротоксины, вызывающие секрецию сока и электролитов, что приводит к водянистой диарее. ETEC не разрушают кисточковую кайму и не внедряются в слизистую оболочку кишечника
Энтеротоксигенная кишечная палочка
Энтеротоксигенные кишечные палочки обладают способностью прикрепляться к эпителиальным клеткам слизистой оболочки тонкой кишки и продуцировать токсины, вызывающих диарею. Энтеротоксигенные кишечные палочки являются основной причиной острых диарей у детей и взрослых и наиболее частой причиной так называемой «диареей путешественников».Энтерогеморрагическая кишечная палочка
Энтерогеморрагические кишечные палочки (EHEC) являются причиной геморрагического колита, а также тяжелого заболевания - гемолитико-уремического синдрома (микроангиопатической гемолитической анемии, сочетающейся с почечной недостаточностью; аббревиатура ГУС или HUS).Для геморрагического колита характерно острое начало в виде сильных спастических болей в животе и водной диареи, которая вскоре становится кровавой. Лихорадка обычно отсутствует, но у некоторых температура тела может достигать 39 °С. В легких случаях геморрагического колита продолжается 7–10 дней. Приблизительно в 5 % случаев геморрагический колит осложняется геморрагическим синдромом, острой почечной недостаточностью и гемолитической анемией.
Источником инфекции мая 2011 года в Германии и других европейских странах являлся штамм продуцирующей шига-токсин STEC (синоним: продуцирующей веротоксин - VTEC) энтерогеморрагической кишечной палочки.
Заражение STEC или VTEC-кишечной палочкой происходит чаще всего через продукты питания или при близком контакте с больными людьми или животными. Для начала заболевания достаточно небольшого числа STEC/VTEC Escherichia coli .
Установлено, что возбудителем европейской инфекции мая 2011 года является кишечная палочка серологической группы E. coli O104 (серотип E. coli O104:H4), имеющая в своем геноме ген, ответственный за продукцию шига-подобного токсина 2-го типа. В отличие от классических энтерогеморрагических кишечных палочек (E. coli О157:Н7), штаммы E.coli O104:H4 не имеют еае-гена, ответственного за продукцию белка интимина, который является фактором адгезии.
Штаммы E. coli O104:H4, выделенные от пациентов, характеризовались резистентностью к бета-лактамным антибиотикам за счет продукции бета-лактамазы расширенного спектра, но оставались чувствительными к группе аминогликозидов (гентамицин) и фторхинолонам.
После заражения энтерогеморрагической кишечной палочкой инкубационный период длится чаще всего от 48 до 72 часов, но может быть и от 1 до 10 дней. Симптомы заражения включают схваткообразные боли в животе и диарею, нередко с кровью. Могут наблюдаться лихорадка и рвота. Большинство больных выздоравливают в течение 10 дней. Иногда инфекция может приводить к опасным для жизни состояниям, таким как гемолитико-уремический синдром.
Энтероинвазивная кишечная палочка
Энтероинвазивная кишечная палочка часто обозначается аббревиатурой на латинице - EIEC. Энтероинвазивные кишечные палочки являются причиной заболеваний, похожих по проявлению на бактериальную дизентерию (причиной которой являются шигеллы). Штаммы EIEC подобны штаммам Shigella как биохимически, так и серологически. Как и в случае Shigella , энтероинвазивные кишечные палочки проникают в эпителиальные клетки ободочной кишки и размножаются там. У больного отмечаются боли в животе, обильный водянистый понос с примесью крови. В развивающихся странах штаммы EIEC встречаются редко. Они служат причиной возникновения периодических вспышек инфекций пищевого происхождения среди детей и взрослых. Симптомы заболевания имеют много общего с проявлениями шигеллёза. Предположительно против EIEC эффективны те же антибиотики, что и против Shigella при условии сохранения чувствительности этого штамма на той или иной территории, однако результативность терапии еще никогда не оценивалась в рамках контролируемых исследований.Escherichia coli - возбудитель заболеваний мочеполовых органов
Инфицирование кишечными палочками (а также другими уропатогенными микробами, обитающими в кишечнике) мочеполовых органов, особенно у женщин, часто происходит непосредственно из желудочно-кишечного тракта при недостаточном соблюдении гигиены или применении специфических сексуальных практик. Кишечная палочка попадает во влагалище из прямой кишки. Кишечные палочки являются причиной:- около 80 % внебольничных инфекций мочевыводящих путей
- 64 % всех заболеваний острым простатитом
- 80 % всех хронических простатитов
- для пациентов старше 35 лет - большей части всех эпидидимитов (воспалительный процесс в придатке яичка), орхитов (воспаление яичка) и эпидидимоорхитов (сочетанное воспаление яичка и придатка яичка)
- 70-95 % инфекций мочевых путей, достигающих мочевого пузыря или почки восходящим путем
- других заболеваний мочеполовых органов.
Кишечная палочка в моче
Бактериурия - наличие бактерий в моче может является признаком воспаления в мочевыводящих путях, мочевом пузыре, почках. При отсутствии каких-либо симптомов, истинная бактериурия (инфекция мочевых путей) диагностируется при наличии не менее 10 5 микробных тел кишечных палочек (или других энтеробактерий) в 1 мл свежевыпущенной мочи, иначе предполагается, что загрязнение мочи происходит при ее заборе. Если бактериурия не сопровождается какими-либо симптомами, тогда она называется бессимптомной. Бессимптомная бактериурия не всегда требует немедленного лечения. При наличии симптомов или при заборе мочи катетером диагностический порог может быть значительно уменьшен. В частности, при наличии клинической симптоматики (лихорадка, озноб, тошнота, рвота, боли в поясничной области, дизурия) и выделении не менее 10 лейкоцитов в 1 мкл мочи, критерием для диагностики острого пиелонефрита является наличие не менее 10 4 кишечных палочек (или других патогенных энтеробактерий) в 1 мл свежевыпущенной мочи. Острый цистит диагностируется при наличии соответствующей клинической симптоматики, выделении не менее 10 лейкоцитов в 1 мкл мочи и обнаружении не менее 10 2 кишечных палочек (или других колиформных бактерий) в 1 мл мочи.
Штаммы Escherichia coli - пробиотики и компоненты лекарств
Штамм кишечной палочки Escherichia coli Nissle 1917
(DSM 6601) считается наиболее эффективным пробиотиком, помогающим уменьшить воспаление и оттянуть следующий приступ язвенного колита (Пробиотики. Что это такое и что они могут дать?). Этот штамм входит, в частности, в состав пробиотика Mutaflor (фирма Ardeypharm). Специально подобранные штаммы эшерихии коли входят в состав лекарств: Хилак форте (штамм DSM 4087), Бификол (штамм М-17), Колибактерин (штамм М-17) и других.
Антибиотики, активные в отношении кишечной палочки
Антибактериальные средства (из имеющих описание в данном справочнике), активные в отношении кишечной палочки: амоксициллин, левофлоксацин, нифурател, нифуроксазид, рифаксимин, фуразолидон, ципрофлоксацин.Изобретение относится к биотехнологии, касается получения продуцентов для пробиотических препаратов - бактерийных препаратов на основе живых культур микроорганизмов-симбионтов, используемых для профилактики и лечения дисбактериозов и других расстройств желудочно-кишечного тракта. В штамм Escherichia coli М17 - продуцент для пробиотического препарата колибактерин - введена неконьюгативная, немобилизуемая плазмида p Сolap, несущая гены продукции колицина Е1 и детерминант устойчивости к ампициллину в дозах до 150 мг/л. Полученный штамм лишен нежелательного адгезивного фенотипа инактивированием гена адгезина fimH пилей 1-го типа интеграцией гена устойчивости к канамицину - неомицину npt. Штамм E.coli М17 fim H::Kan/p Colap депонирован в ВКПМ под номером В-7448, Это позволяет создать пробиотический препарат со сниженной способностью к колонизации отличных от интестинальной ниш, с повышенной антагонистической активностью и резидентный на фоне антибиотикотерапии. Введенные в сконструированный штамм признаки стабильно сохраняются в популяции. Это облегчает получение стандартного препарата на основе штамма и гарантирует, что при приеме препарата пациентом без сопутствующей антибиотикотерапии не произойдет элиминация плазмиды. 4 ил., 1 табл.
Настоящее изобретение относится к биотехнологии и касается создания усовершенствованного штамма Escherichia coli, который может быть использован для получения пробиотиков - бактерийных препаратов на основе живых культур микроорганизмов-симбионтов. Пробиотики (другие названия препаратов данной группы: нормофлоры, эубиотики, микробиотики) являются эффективным средством для профилактики и лечения дисбактериоза кишечника. Дисбактериоз - это выраженное изменение в видовом и количественном соотношении микробов, которое проявляется в бурном развитии условно-патогенных микроорганизмов, в частности бактерий семейства кишечной группы (Enterobacteriaceae), и сопровождается различными болезненными проявлениями. Важной причиной дисбактериозов является применение антибиотиков и других противомикробных препаратов [Красноголовец В. Н. "Клиническое значение дисбактериоза кишечника, развившегося в результате применения антибиотиков". В кн. "Применение колибактерина для профилактики и лечения кишечных заболеваний и технология его производства". М., 1967, с. 223 - 243]. В настоящее время в России известны препараты пробиотиков "Колибактерин" и "Бификол", которые получают на основе штамма Escherichia coli М17, который, по-существу, является производным штамма Е.coli, выделенного А. Ниссле и используемого для получения препарата "Mutaflor" (Германия) [Перетц Л.Г. "Сухой колибактерин. Новые методы диагностики, лечения и профилактики кишечных заболеваний". В кн. "Тезисы докладов Пленуму Уч. мед. сов. МЗ РСФСР". М., 1961, с. 52-54]. Однако, в отличие от исходного штамма штамм Е. coli М17 утратил способность к синтезу колицина B и, следовательно, снизил свою антагонистическую активность в отношении бактерий кишечной группы [Шемчук Л.Ф. "Стандартизация колибактерина", автореф. канд.б.н., М., 1983, с. 16]. Другим недостатком штамма Е.coli М17 и его предшественника является наличие у них высокоадгезивного М н фенотипа фимбрий 1-го типа, необычного и нежелательного для кишечного штамма. Такой фенотип часто обнаруживается у выделяемых из макроорганизма штаммов при инфекции мочевыводящих путей и внутрибольничной пневмонии [Сокуренко Е.В., Чеснокова В.Л. "Способ модификации адгезивного фенотипа диких изолятов Е. coli в применении к штаммам - продуцентам препарата колибактерин". Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1997, Том 124, N 9, с. 334 - 338]. Недостатком штамма E.coli М17 является также чувствительность его к антибиотикам. Поэтому препараты на его основе не могут быть эффективными на фоне приема антибиотиков. Между тем одновременное применение антибиотиков и пробиотиков может предотвращать развитие дисбактериоза и тем самым повышать эффективность терапевтических мероприятий, сокращать сроки лечения. Задачей изобретения является создание штамма Е.coli - производного E.coli М17, который позволяет устранить упомянутые выше недостатки известного штамма Е. coli М17, а именно: пониженная антагонистическая активность, нежелательный адгезивный фенотип, чувствительность к антибиотикам. Технический результат состоит в конструировании штамма с повышенной антагонистической активностью, сниженной способностью к колонизации отличных от первичной интестинальной ниш в макроорганизме и с резистентностью к умеренным дозам антибиотиков пенициллинового ряда. Указанная цель достигается тем, что с помощью генетических и генно-инженерных методов конструируют штамм Е.coli М17 fimH::kan/pColap, который продуцирует колицин E1, устойчив к умеренным концентрациям ампициллина (до 150 ЕД/мл) и содержит инактивированный ген fimH, кодирующий фимбриальный адгезин. Штамм Е.coli М17 fimH::kan/pColap депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером В-7448. В основе патентуемой конструкции штамма лежат следующие положения. Нами впервые показано, что инактивирование гена адгезина fimH пилей 1-го типа в геноме Escherichia coli штамма М17 и введение в штамм Escherichia coli М17 неконьюгативной, немобилизуемой плазмиды pColap, несущей гены продукции колицина E1 и детерминант устойчивости к ампициллину в дозах до 150 мг/л позволяет создать пробиотический препарат со сниженной способностью к колонизации отличных от интестинальной ниш, с повышенной антагонистической активностью и резидентный на фоне антибиотикотерапии. Сущность патентуемого генно-инженерного решения поясняется чертежами, где: на фиг. 1 показана схема получения рекомбинантного штамма E. coli M17fimH::kan/pColap с дефектом в гене адгезина fimH пилей 1-го типа, на фиг. 2 - схема конструирования гибридной плазмиды pColap, на фиг. 3 приведены результаты исследования адгезивной активности сконструированного штамма Escherichia coli М17 fimH::kan/pColap, на фиг. 4 - результаты исследования стабильности сконструированного штамма Escherichia coli М17 fimH::kan/pColap. При получении штамма Е.coli М17 fimH::kan/pColap в качестве исходного использовали его ближайший аналог - штамм Е.coli М17. Для элиминации фимбриального адгезина, сообщающего клеткам Е.coli М17 нежелательный высокоадгезивный М н фенотип, получали рекомбинантный штамм, у которого в хромосомный ген fimH, кодирующий адгезин, был интегрирован ген устойчивости к канамицину-неомицину npt. С этой целью использовали плазмиду pCH103, производную плазмиды R6K, которая имеет pir-зависимую систему репликации и может поддерживаться только в штаммах, содержащих ген pir, обеспечивающий ее репликацию [Сокуренко Е.В., Чеснокова В.Л. "Способ модификации адгезивного фенотипа диких изолятов Е.coli в применении к штаммам - продуцентам препарата колибактерин". Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1997, Том 124, N 9, с. 334 - 338]. Плазмида pCH103 несет ген устойчивости к ампициллину и фрагмент хромосомы, содержащий гены fim-кластера, в котором целостность гена fimH нарушена вставкой гена устойчивости к канамицину (неомицину) npt. После трансформации ее в штамм Е.coli М17 она не может поддерживаться в клетках, и устойчивые к канамицину трансформанты могут возникать или при интеграции ее целиком в хромосому в результате одного кроссинговера или в результате двойного кроссинговера (фиг. 1). Трансформанты второго класса остаются чувствительными к ампициллину. Среди них был отобран штамм, обозначенный Е.coli M17fimH::kan (или М17 fimH::npt). Проведенное исследование подтвердило отсутствие у полученного штамма маннозо-чувствительной адгезии, т.е. FimH - фенотип. Для повышения антагонистической активности штамма Е. coli М17 и придания ему устойчивости к ампициллину на основе плазмиды ColE1 известными методами ["Методы молекулярной генетики и генной инженерии", 1990, Новосибирск, "Наука", Сибирское отделение, с. 7-10, 39-44] была сконструирована гибридная плазмида pColap (фиг. 1). Исходная плазмида ColE1, выделенная из непатогенного штамма Е.coli, детально изучена. Она имеет довольно узкий круг хозяев (в основном - штаммы кишечной палочки) и стабильно поддерживается в бактериальных клетках. Известны ее полная нуклеотидная последовательность, функции всех ее генетических элементов, регуляция их активности. Плазмида детерминирует синтез колицина E1, который губительно действует на клетки родственных бактерий. Недостатком плазмиды ColE1 является ее способность к мобилизации в другие клетки с помощью конъюгативных плазмид, которая обусловлена присутствием в ее структуре mob-области. Используя эндонуклеазу рестрикции BspLu11.1, эту область полностью удалили и при этом практически не затронули другие генетические элементы плазмиды. Затем, используя эндонуклеазу рестрикции BspH1, из известного вектора pUC19 вырезали фрагмент, содержащий ген b1a, кодирующий синтез - лактамазы, и лигировали его с фрагментом плазмиды ColE1, лишенным mob-области. В результате получили плазмиду pColap. Эта плазмида неконъюгативна и немобилизуема и, следовательно, практически не может быть передана в клетки других бактерий. В отличие от вектора pUC19 и других плазмид pColap обеспечивает только умеренный уровень устойчивости к ампициллину трансформированным ею штаммам Е.coli (табл. 1). Такое ухудшение экспрессии гена - лактамазы наблюдается из-за нарушений в промоторной области гена (боксе Гильберта) и 5" - участке, повышающем эффективность экспрессии , произошедших в результате генетических манипуляций в процессе конструирования рекомбинантной плазмиды pColap. Чувствительность штаммов, несущих pColap, к повышенным концентрациям антибиотика следует считать благоприятным фактором. Так, если по каким-либо причинам присутствие штаммов, содержащих эту плазмиду, в кишечнике пациента становится нежелательным или если в результате какого-либо исключительного события плазмида переносится в другой штамм, то все клетки, содержащие ее, можно элиминировать из организма, применив высокие концентрации -лактамных антибиотиков. Плазмидой pColap трансформировали штамм Е. coli М17 fimH::kan и получили штамм Е.coli М17 fimH::kan/pColap. Штамм имеет следующие характеристики. Морфология. Грамотрицательные слабоподвижные тонкие палочки с закругленными концами 1,5 - 2 мкм в длину. Культурально-физиологические признаки. Мясо-пептонный агар и агаризованный бульон Хотингера. Через 36 ч роста при 37 o C образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5 - 2,5 мм, поверхность колоний гладкая, края ровные, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируются. Агаризованная минимальная среда М9 с глюкозой (0,2%). Через 40 ч роста образует колонии 1-2 мм в диаметре, серовато-беловатые, полупрозрачные, круглые, выпуклые, с ровными краями. Мясо-пептонный бульон и бульон Хотингера. Через 18-24 ч роста при 37 o C наблюдается сильное равномерное помутнение, небольшой осадок, характерный запах. Жидкая минимальная среда М9 с глюкозой (0,2 %). Через 20-24 ч роста с аэрацией наблюдается сильное равномерное помутнение, запах слабый или отсутствует. Рост по уколу в мясо-пептонном агаре. Хороший рост по всему уколу. Микроорганизм является факультативным анаэробом. Отношение к температуре и pH среды. Хорошо растет при температуре от 30 до 42 o C и при pH 6,8 - 7,2. Биохимические свойства. Хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, маннозу, ксилозу, маннит и сорбит с образованием кислоты и газа. Рамнозу, галактозу и арабинозу - со слабым кислотообразованием; салицин - с замедленным кислото- и газообразованием; рафинозу - только с кислотообразованием. Инозит не усваивает. Сероводород не образует; индол вырабатывает. Отношение к антибиотикам. Устойчив к ампициллину при концентрациях в среде до 150 мг/л. Продукция бактериоцинов. Продуцирует колицин E1. Содержание плазмид. Клетки содержат многокопийную неконъюгативную и немобилизуемую плазмиду pColap (5239 п.н.), детерминирующую устойчивость к ампициллину и синтез колицина E1. Штамм имеет антигенную формулу О2:L1:H6 и агглютинируется сывороткой при титре сыворотки не ниже 1:64000. Изобретение иллюстрируется примерами, которые характеризуют устойчивость штаммов, несущих различные плазмиды, к ампициллину, стабильность их признаков в процессе культивирования. Пример 1. Изучение роста штамма Е. coli М17 и его производных, содержащих плазмиды, на средах с разными концентрациями ампициллина (табл. 1). Исследуемые штаммы кишечной палочки (таблица 1) выращивались в течение 18 ч в бульоне Луриа (LB - 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на 1 л дистиллированной воды) при 37 o C с аэрацией. Затем готовили последовательные разведения бактериальных культур до 10 -7 в физиологическом растворе и высевали каждую культуру на чашки с LA (LB + 1,6 % агар), содержащие ампициллин в следующих концентрациях (мкг/мл): 5, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250. Оценку роста колоний производили через 18-24 ч. Результаты представлены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, исходный штамм кишечной палочки М17 проявляет высокую чувствительность к ампициллину. Плазмида pUC19, содержащаяся в штамме М17/pUC19, которая явилась источником гена - лактамазы для сконструированной нами плазмиды pColap, придает бактериальной клетке устойчивость к концентрациям ампициллина до 2 г/л. В то же время плазмида pColap, содержащаяся в штамме М17 fimH::kan/pColap, обеспечивает устойчивость к концентрациям ампициллина не выше 150 мг/л. Таким образом, полученные штаммы обладают умеренным уровнем устойчивости к ампициллину. Пример 2. Исследование адгезивных свойств и определение адгезивного фенотипа штамма Е. coli М17 и его производных. Адгезивный фенотип определяли стандартным методом "исследования роста" . Из свежей культуры исследуемых штаммов бактерий готовили суспензию бактериальных клеток в физиологическом растворе с оптической плотностью 1.0 при длине волны 540 нм. Параллельно приготовили планшеты для микротитрования с плоскодонными лунками с иммобилизованными в лунках субстратами для адгезии, а именно: МН (дрожжевой маннан), РН (бычья РНКаза В) и БСА (бычий сывороточный альбумин). Затем бактериальную суспензию помещали в лунки и инкубировали в течение 40 мин. Несвязавшиеся бактериальные клетки тщательно отмывали физиологическим раствором. В лунки добавляли богатую питательную среду и инкубировали с постоянным перемешиванием при 37 o C в течение 2,5 - 3 ч до появления помутнения в лунках. Оптическая плотность в каждой лунке учитывалась на автоматическом ридере микропланшет (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, Calif., USA). В данном эксперименте исследовались следующие штаммы Е.coli: М17 - исходный штамм; М17 fimH::kan - штамм М17 с инактивированным геном адгезина fimH: М17 fimH: : kan/pPKL91 - штамм fimH::kan, трансформированный плазмидой pPKL91, содержащей регуляторный ген fimB, включающий экспрессию пилей 1-го типа бактериальной клеткой; штамм M17fimH::kan/pColap - штамм М17 fimH::kan, трансформированный сконструированной нами плазмидой pColap, несущей детерминанты устойчивости к ампициллину и продукции колицина Е1. Результаты исследования адгезивной активности штаммов Е.coli М17 и производных штамма Е.coli М17, оцененной с помощью метода "исследования роста", представлены на фиг. 3 (по оси ординат отложены значения оптической плотности при длине волны 540 нм; на оси абсцисс - исследуемые штаммы Е. coli: 1 - М17; 2 - М17 fimH::kan, 3 - M17fimH::kan/pPKL91, 4 - М17 fimH::kan/pColap). Как видно из фиг. 3, исходный штамм Е. coli М17 хорошо связывается и с РНКазой B, и с маннаном, что указывает на МН адгезивный фенотип, нежелательный для интестинального штамма кишечной палочки. Полученный нами рекомбинантный штамм М17 fimH::kan проявляет нулевую адгезивную активность как сам по себе, так и после введения в него плазмиды, включающей экспрессию пилей 1-го типа. Нулевая адгезиная активность сохраняется в этом штамме и после введения в него плазмиды pColap (штамм М17 fimH::kan/pColap). Пример 3. Исследование стабильности признаков штамма Escherichia coli М17 fimH::kan/pColap, детерминируемых плазмидой pColap. Сконструированная нами плазмида pColap обеспечивает продукцию колицина Е1 и устойчивость к ампициллину. Сохранение этих признаков зависит от стабильности поддержания плазмиды в клетках бактерий: утрата плазмиды сопровождается утратой соответствующих признаков. Определяли стабильность сохранения устойчивости к ампициллину и колициногенности полученных штаммов при культивировании их в жидкой питательной среде в отсутствие селективного агента на протяжении 100 генераций. В качестве положительного контроля использовали исходную плазмиду ColE1, а отрицательного - плазмиду pBR322, производную ColE1, не содержащую локуса cer, который влияет на стабильность плазмид. Культуры штаммов М17 fimH::kan/pColap, М17/ColЕ1 и M17/pBR322 выращивались в течение 18 ч с усиленной аэрацией при 37 o C в LB с ампициллином (100 мкг/мл). Штамм М17/ColЕ1 выращивали в тех же условиях, но без ампициллина. Полученные культуры содержали примерно 10 o бактериальных клеток в 1 мл. Затем в пробирки с 10 мл LB (без добавленного антибиотика) вносили 10 мкл (10 6) соответствующей бактериальной культуры. Полученную суспензию выращивали, как описано выше. При таком культивировании бактериальные клетки успевали пройти 10 делений. Повторив эту операцию 10 раз, мы получили бактериальную культуру, прошедшую 100 генераций с момента первого засева в среду без селективного агента. Перед каждым засевом отбирались пробы бактериальной культуры и проверялись на наличие свойств устойчивости к ампициллину и продукции колицина. Для этого суспензии клеток рассевались на чашках с LA до получения отдельных колоний. Затем по 100 колоний каждого штамма проверялись на способность к росту на той же среде в присутствии ампициллина (100 мкг/мл). Кроме того, колонии проверялись на способность продуцировать колицин Е1. Для этого использовался тест с нанесением верхнего агара (Миллер Дж. "Эксперименты в молекулярной генетике", М. , "Мир", 1976, стр. 183-189). Тест заключается в следующем: на чашки с твердой питательной средой, содержащей 1,6 % агар, репликатором или зубочисткой перекалывают исследуемые колонии. Чашки инкубируют при 37 o C в течение 3 - 4 ч, индуцируют продукцию колицина облучением ультрафиолетом в течение 4-5 с и инкубируют в тех же условиях в течение ночи. Затем клетки лизируют парами хлороформа при комнатной температуре в течение 30 - 40 мин. Важно проследить, чтобы на следующем этапе весь хлороформ выветрился из чашки. Наслаивают на нижний слой агара 3 - 5 мл полужидкого (0,7 %) агара, содержащего 10 7 /мл бактериальных клеток тест-штамма Е. coli (чувствительного к колицину Е1). Инкубируют ночь при 37 o C. Регистрируют наличие зон просветления в слое тест-культуры вокруг пятен исследуемых штаммов. Результаты исследования стабильности сконструированного штамма Escherichia coli М17/pColap приведены на фиг. 2 (ColE1 соответствует штамму М17/ColЕ1, pBR322 - штамму M17/pBR322, pColap - штамму М17/pColap). Присутствие плазмиды в бактериальной клетке следует из сохранения ею исходных свойств (колициногенности и/или устойчивости к ампициллину). Результаты эксперимента (фиг. 2) свидетельствуют, что лишенная cer локуса плазмида pBR322 быстро элиминируется из бактериальной популяции при выращивании в среде, лишенной антибиотика, в то время как две другие плазмиды (исходная ColE1 и рекомбинантная pColap) стабильно наследуются клетками в этих условиях. Это свойство является одним из важным преимуществ нашей конструкции, поскольку, с одной стороны, облегчает получение стандартного препарата на основе штамма, содержащего pColap, а с другой стороны, гарантирует, что при приеме препарата пациентом без сопутствующей антибиотикотерапии не произойдет элиминация плазмиды. Промышленная применимость. Приведенное описание способа конструирования патентуемого штамма Escherichia coli М17 rimH::kan/pColap достаточно для повторного получения штамма с использованием стандартных методик, реагентов и оборудования, применяемых в генно-инженерных исследованиях.
Формула изобретения
Штамм бактерий Escherichia coli M 17 fim H::kan/p Colap ВКПМ В-7448, используемый для получения пробиотического препарата.
Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии и медицине, конкретно к медицинской вирусологии и иммунологии, и может быть использовано для проведения иммунодиагностики геморрагической лихорадки Марбург, а также для получения специфических антител к вирусу Марбург и генно-инженерных вакцин против вируса Марбург
Вконтакте
Одноклассники
(лат. Escherichia coli, E. coli, по имени Теодора Эшериха) - грамотрицательная палочковидная бактерия, широко встречается в нижней части кишечника теплокровных организмов. Большинство штаммов кишечной палочки являются безвредными, однако серотип O157:H7 может вызывать тяжёлые пищевые отравления у людей. Безвредные штаммы являются частью нормальной флоры кишечника человека и животных. Кишечная палочка приносит пользу организму хозяина, например, синтезируя витамин K , а также предотвращая развитие патогенных микроорганизмов в кишечнике.
Кишечная палочка была описана немецким педиатром и бактериологом Теодором Эшерихом в 1885 году.
Штаммы
Штамм - это совокупность особей внутри вида, которая обладает свойствами, отличными от свойств других особей. Часто такие отличия могут быть обнаружены только на молекулярном уровне, однако, имеют эффект на физиологию бактерии или жизненный цикл. Разные штаммы кишечной палочки часто специфичны к определённым хозяевам, что делает возможным определение источника фекального заражения в образцах. Например, если известно, какие штаммы кишечной палочки представлены в образце воды, можно определить источник заражения, например, человек, другое млекопитающее или птица.
Новые штаммы кишечной палочки появляются в результате мутаций и горизонтального переноса генов. Некоторые штаммы вырабатывают особенности, губительные для организмов хозяина, такие ядовитые штаммы могут вызывать диарею, что неприятно в случае взрослых и может привести к летальному исходу у детей в развивающихся странах. Более ядовитые штаммы, например, O157:H7 вызывают тяжёлые заболевания и даже приводят к смерти у пожилых людей, маленьких детей и лиц с ослабленным иммунитетом.
Роль в нормальной микрофлоре
Некоторые штаммы кишечной палочки, например, O157:H7, O121 и O104:H21, синтезируют потенциально смертельные токсины. Пищевые отравления, инфекционным агентом при которых являются ядовитые E. coli, обычно вызваны употреблением в пищу немытых овощей или непрожаренного мяса.
Желудочно-кишечные инфекции
Ядовитые штаммы кишечной палочки в норме отсутствуют в кишечнике, и заболевание наступает при заражении извне. Передача патогенных E. coli часто происходит фекально-оральным путём.
Частые пути передачи могут быть вызваны:
- низкой гигиеной приготовления пищи,
- загрязнением продуктов навозом,
- поливом урожая загрязнённой водой или сточными водами,
- при выпасе диких свиней на пашнях,
- употреблением для питья воды,
- загрязнённой сточными водами.
Помимо этого, нарушить нормальную микрофлору кишечника может прием некоторых антибиотиков, подавляющих те микроорганизмы, которые отвечают за предотвращение размножения патогенной флоры.
Заражение патогенными штаммами кишечной палочки происходит преимущественно фекально-оральным путем. Способствует развитию заболеваний нарушение правил гигиены приготовления пищи, употребление грязных фруктов и овощей, использование для полива загрязненной или сточной воды и проч. Опасно также есть плохо прожаренное мясо или пить некипяченое молоко , ведь коровы, козы, свиньи и овцы могут быть носителями патогенных штаммов E. coli.
Симптомами кишечной палочки становится развернутая клиническая картина кишечного дисбактериоза: помимо расстройств стула (запоры , поносы), у больного наблюдаются тошнота и рвота, вздутие и боль в животе. Меняется запах каловых масс, появляется неприятный запах изо рта. Среди симптомов общей интоксикации – повышенная утомляемость, слабость, сонливость, отсутствие аппетита.
В случае заболеваний кишечника у новорождённых, при болезни Крона и при неспецифическом язвенном колите обнаруживают повышенные уровни кишечной палочки в слизистых ЖКТ.
Лечение кишечной палочки
Лечение кишечной палочки заключается в приеме специально подобранных антибиотиков. Чаще всего это препараты из группы аминогликозидов. Чтобы лечение было более эффективным, больному рекомендуется сделать посев содержимого кишечника. Если кишечная палочка вызвала диарею, необходимо восстановление водно-электролитного баланса с помощью регидратации. В целом, лечение зависит в первую очередь от штамма кишечной палочки.
Важно! Лечение проводится только под контролем врача. Самодиагностика и самолечение недопустимы!
Кишечная палочка (эшерихии) в организме человека в норме заселяет весь пищеварительный канал. Выделяют различные штаммы (виды) кишечной палочки, которые выполняют полезные функции в организме. Однако некоторые агрессивные разновидности могут вызвать заболевание у детей и взрослых.
Кишечную палочку (эшерихию) новорожденный получает с молоком матери и при непосредственном контакте с окружающими людьми в первые сутки от момента рождения. На протяжении всей жизни определенные штаммы кишечной палочки постоянно присутствуют на поверхности слизистой кишечника, выполняя определенные полезные функции. Это так называемые комменсалы – обязательные представители собственной .
При нарушении гигиенических моментов в организм человека проникают патогенные виды кишечной палочки, которые вызывают симптом различных заболеваний.
Непатогенные кишечные палочки
Эшерихии в пищеварительном канале выполняют определенные функции:
- препятствуют заселению слизистой ЖКТ (микробный антагонизм);
- участвуют в синтезе витаминов группы В и К;
- обеспечивают процессы расщепления, всасывания и переваривания некоторых пищеварительных веществ.
Большое значение играет не только факт присутствия непатогенных штаммов кишечной палочки внутри пищеварительного канала человека, но и ее количество. При снижении количества эшерихий ниже допустимого уровня отмечается ухудшение всех вышеописанных процессов. При затянувшемся процессе формируется – нарушение микробного соотношения в пищеварительном канале.
Определить качественный и количественный в целом и кишечной палочки в частности можно с помощью развернутого бактериологического исследования (так называемый ) и .
Патогенные виды кишечной палочки
Среди патогенных штаммов кишечной палочки выделяют:
- энтеропатогенные;
- энтеротоксигенные;
- энтероинвазивные;
- энтерогеморрагические.
Для каждой группы характерна определенная клиническая симптоматика.
Источником инфекции при эшерихиозе может быть как больной человек, так и инфицированное животное. Среди возможных путей передачи на первом месте стоит пищевой, после него контактный и водный.
Энтеропатогенные виды кишечной палочки вызывают развитие (поражения тонкой и толстой кишки) у детей раннего возраста (в том числе и первого года жизни). Источником инфекции является взрослый человек (родственники или чаще всего медицинский персонал), наибольшую значимость имеет так называемый носитель. Передача инфекции осуществляется контактно-бытовым путем (через предметы обихода и медицинский инструментарий).
Энтероинвазивные виды кишечной палочки вызывают острые кишечные нарушения у детей более старшего возраста и у взрослых людей. Источником инфекции также является человек, ведущий путь передачи – пищевой. Среди возможных пищевых факторов передачи инфекции наиболее значимы:
- молочные продукты (кефир, ряженка, творог, простокваша);
- разнообразные салаты;
- мясные продукты (студень, холодец);
- напитки, не подвергающиеся термической обработке (квас, компот, соки в нестерильной таре).
Энтеротоксигенные разновидности кишечной палочки вызывают кишечные расстройства у детей дошкольного возраста. Наиболее распространены в странах с тропическим и субтропическим климатом, поэтому рассматриваются как возможный возбудитель так называемой . Наиболее характерный путь передачи – водный, так как для развития клинической симптоматики необходимо проникновение в организм человека достаточно большой дозы патогенного варианта кишечной палочки.
Энтерогемолитические разновидности кишечной палочки изучены меньше. Вызывают поражение пищеварительного канала у взрослых людей. Предполагаемый источник инфекции – крупный рогатый скот, а возможные факторы передачи – продукты животного происхождения, не проходящие достаточную термическую обработку (мясо с кровью, непрожаренный шашлык, молоко некипяченое).
Факторы размножения и роста
Размножению и росту бактерий способствует любая погрешность в выполнении санитарно-гигиенических правил:
- недостаточно тщательное мытье рук;
- употребление сырой водопроводной или колодезной воды;
- неправильное мытье посуды, овощей и фруктов (холодной водой, без моющего средства и без щетки);
- редкая смена нательного и постельного белья.
Все это приводит к попаданию кишечной палочки в пищеварительный канал и другие системы органов. Это вызывает развитие нарушений и тяжелых заболеваний репродуктивной и мочевыделительной сферы, а также нервной системы.
Симптомы заболеваний, вызываемых кишечной палочкой
Если патогенная кишечная палочка проникает в пищеварительный канал человека, то наблюдается такая клиническая симптоматика:
- продолжительная тошнота и повторные эпизоды рвоты;
- боль в животе умеренной интенсивности и разлитого характера;
- жидкий стул, иногда с примесью крови и слизи (при поражении инвазивными штаммами);
- ухудшение общего состояния (повышение температуры тела, слабость, снижение аппетита).
При поражении мочевыделительного тракта и репродуктивной сферы клинические проявления неспецифичны: доминирует болевой синдром. Кишечная палочка наиболее опасна, если попадает в кровь или центральную нервную систему. В этом случае развивается заражение крови (сепсис) или менингит (менингоэнцефалит). Развиваются тяжелые нарушения функций внутренних органов, которые могут привести к смерти больного.
Варианты обнаружения бактерии
Присутствие кишечной палочки допустимо только в пищеварительном канале. Можно даже сказать, что эшерихия обязательно должна выделяться из пищеварительного тракта здорового человека.
В других биологических жидкостях (кровь, моча, вагинальный секрет, мазок из уретры) кишечная палочка отсутствует.
Если кишечная палочка обнаружена в моче или вагинальном секрете (мазке из уретры), то следует повторить исследование. Вполне возможно, что сбор биологического материала был проведен с нарушениями: недостаточно тщательно помытые руки и половые органы или нестерильный контейнер. Если и при повторном обнаруживается эшерихия, то это свидетельствует о патологическом процессе. Как правило, наблюдаются и другие признаки воспалительных изменений. Лечение необходимо в соответствии с выраженностью клинических проявлений.
Худший вариант – обнаружение кишечной палочки в крови или спинномозговой жидкости. Это признак тяжелой генерализованной инфекции, требующий немедленного комплексного лечения.
Лечение
Лечение кишечной палочки зависит от локализации патологического процесса. Непосредственное воздействие на патогенный штамм эшерихии оказывают
