В настоящей главе рассматриваются вопросы, связанные с проявлениями нежелательной иммуногенности препаратов моноклональных антител (далее – МкАТ), предназначенных для клинического применения. К ним относятся факторы, влияющие на иммуногенность МкАТ, клинические последствия иммуногенности, аналитические проблемы, оценка нейтрализующих антител на моноклональные антитела и вопросы подхода, основанного на рисках, к анализу иммуногенности МкАТ.
1. Введение
Проявление нежелательной иммуногенности может быть значительной проблемой при лечении пациентов биологическими лекарственными препаратами. Рекомендации по оценке иммуногенности лекарственных препаратов на основе белков, полученных с использованием биотехнологии, представлены в главе 11 настоящих Правил, которые применимы и к лекарственным препаратам МкАТ. Несмотря на то, что многие аспекты иммуногенности МкАТ не отличаются от аспектов иммуногенности других терапевтических белков, некоторые из них требуют более пристального рассмотрения. Индукции моноклональными антителами антител, которые перекрестно реагировали и нейтрализовали бы эндогенные антитела (как, например, в случае с эритропоэтином), не ожидается, поскольку их не применяют в качестве заместительной терапии.
Чаще всего лекарственные препараты МкАТ применяются в качестве терапевтических или диагностических средств при наличии терапевтической или диагностической альтернативы. Тем не менее некоторые специфичные аспекты иммуногенности характерны исключительно или преимущественно для препаратов МкАТ или новых препаратов на основе модифицированных МкАТ (например, Fab-фрагментов, scFv-одноцепочечных Fv- фрагментов, нанотел, миниантител), которые рассматриваются в настоящей главе. Препараты МкАТ представляют значительную и очень важную подгруппу биологических лекарственных препаратов.
Диапазон показаний к применению МкАТ при лечении заболеваний очень широк. Применение многих препаратов МкАТ сопровождается проявлениями нежелательной иммуногенности, в некоторых случаях это приводит к неполноценному клиническому ответу или развитию редких серьезных нежелательных реакций, которые требуют клинического вмешательства. Широкий спектр разрабатываемых и зарегистрированных по различным показаниям к применению препаратов МкАТ препятствует составлению частных рекомендаций, применимых во всех ситуациях.
2. Область применения
Общие принципы касаются вопросов разработки и проведения систематизированной оценки нежелательного иммунного ответа у реципиентов после введения им терапевтического или in vitro диагностического МкАТ. Требования относятся к препаратам МкАТ, их производным (например, Fab фрагменты, ScFv, наноантитела, миниантитела) и продуктам, содержащим компоненты МкАТ (например, конъюгаты, Fc-связанные гибридные белки).
В настоящей главе рассматриваются основные аспекты качества и клинические проявления, имеющие важное значение для адекватного решения проблем выявления и оценки риска развития нежелательного иммунного ответа на применение конкретного препарата МкАТ у пациентов с определенным заявленным показанием к применению. Положения, приведенные в настоящей главе, распространяются на препараты, находящиеся на завершающей стадии разработки, в частности, на этапе подачи заявления о регистрации, однако многие положения применимы и к более ранним этапам разработки препаратов МкАТ.
3. Общие положения
Настоящую главу следует рассматривать в совокупности с другими главами настоящих Правил и иными соответствующими актами, входящими в право Союза.
4. Проблемы скрининговых и подтверждающих исследований, используемых при оценке иммуногенности препаратов моноклональных антител
4.1. Аналитические методы обнаружения антител
Для определения содержания антител к препарату МкАТ могут быть использованы любые форматы иммунологических методов количественного определения. Вместе с тем методы количественного определения, использм образом, простые методы, например, ИФА или радиоиммунная преципитация непригодны для МкАТ, если только их не приспособили к преодолению указанного затруднения. В связи с этим необходимо разработать другие подходы к определению МкАТ.
Общий подход состоит в использовании «связующего» формата, например, для ИФА или электрохемилюминесценции (далее – ЭХЛ), которые не требуют анти-иммуноглобулиновых реактивов, и поэтому могут напрямую использоваться в исследованиях с МкАТ. В некоторых случаях этот метод может быть менее чувствительным, чем другие иммунологические методы, и требовать существенных усилий при разработке, чтобы создать подходящий метод количественного определения. Он также недостаточно эффективно обнаруживает образующиеся в некоторых случаях IgG4-антитела.
Другим подходом является использование метода поверхностного плазмонного резонанса (далее – ППР). Он не требует использования антииммуноглобулиновых реактивов для обнаружения антител к МкАТ. Этот метод идет в реальном времени, вследствие чего он быстр и позволяет обнаруживать быстро диссоциирующиеся антитела, которые могут быть упущены другими методами.
Поскольку ППР просто обнаруживает связывание белка с покрытым чипом, необходимо подтвердить, что сигнал исходит от антител. Он может быть менее чувствительным по сравнению с другими методами обнаружения высоко аффинных антител и в отсутствие автоматизированной системы пробоподготовки может иметь низкую производительность (низкий выход). Пробы (как правило, сыворотка или плазма) могут содержать вещества, способные искажать результаты анализа, то есть вызывать эффект матрицы, заключающийся в получении ложноположительных или ложноотрицательных результатов и (или) неправильной оценке содержания антител.
4.2. Наличие препарата моноклональных антител в образцах для анализа
Интактные препараты МкАТ имеют относительно длительные периоды полувыведения и сохраняются в кровотоке в течение длительного времени. Даже их фрагменты могут находиться в крови в течение нескольких дней. Это может существенно осложнить обнаружение иммунного ответа вследствие наличия препарата МкАТ в пробах, собранных в целях обнаружения антител. Это, как правило, приводит к артефактно низкой оценке содержания антител в соответствующих (пораженных) пробах и может быть настолько выраженным, что может привести к ложноотрицательным результатам. Предложено несколько подходов преодоления указанных сложностей.
Первый подход заключается в том, чтобы отложить отбор проб до снижения содержания препарата МкАТ до значений, не вызывающих затруднений. Этот подход позволяет решить проблему некоторых препаратов МкАТ, но требует тщательного изучения, поскольку может привести к невыявлению иммуногенности вследствие снижения содержания индуцированных антител до необнаруживаемых количеств к моменту отбора проб.
Другой подход заключается в использовании методологии, которая наименее подвержена влиянию указанной проблемы. Представляется, что методики, основанные на ЭХЛ, гораздо меньше подвержены влиянию остаточного содержания препарата в пробах, чем другие методы, включая стандартные связующие ИФА. Широко описываемой методикой решения проблемы является включение в Документ, описывающий цели и методологию эксперимента для проведения исследования и включающий в себя все внесенные в него поправки.
план исследования
предварительного этапа диссоциации комплекса антиген-антитело, чтобы разрушить все комплексы перед определением антител.
Описаны различные версии методик, включая кислотную инкубацию, в некоторых случаях вместе с аффинным разделением препарата, однако следует с осторожностью анализировать их результаты, поскольку дополнительные этапы могут приводить к невалидности методики. В рамках третьего подхода можно подвергнуть пробы разведению, чтобы добиться остаточного содержания препарата, не влияющего на методику. Этот подход требует соблюдения большой осторожности, поскольку может привести к ложноотрицательному заключению об иммуногенности вследствие недостаточной чувствительности обнаружения антител в разведенных пробах с помощью такой методики. В некоторых случаях остаточное содержание МкАТ в пробах необходимо подвергать количественному определению. Во многих случаях в целях снижения искажающего влияния препарата при разработке метода обнаружения антимоноклональных антител, его валидации и испытании используется комбинация всех трех подходов.
4.3. Подтверждающие анализы
Подтверждающие методы количественного определения подвержены тем же проблемам, что и скрининговые. Необходимо подобрать правильный подтверждающий метод количественного определения, принимая во внимание использованный скрининговый метод. Допускается использование протеина A и протеина G в подтверждающих методах для того, чтобы подтвердить, что положительный результат действительно обусловлен иммуноглобулином, однако в этих целях допускается использовать и другие подходы.
4.4. Контрольные образцы
Ключевой проблемой исследований иммуногенности МкАТ является наработка сывороток, которые будут служить положительным контролем. Выбранная сыворотка, являющаяся положительным контролем, или очищенное антитело необходимы для мониторинга чувствительности и специфичности метода количественного определения. Если сыворотку человека получить невозможно (например, на ранних фазах разработки препарата), то единственным выходом остается использование сыворотки животных.
Выбор видов животных для этих целей приводит к важным последствиям. Нечеловекообразные приматы вырабатывают выраженный анти-CDR и антикаркасный ответ на человеческие и гуманизированные МкАТ, что может очень сильно имитировать ответ организма человека и служить подходящим положительным контролем. Тогда как неприматы вырабатывают антитела преимущественно к константным участкам МкАТ, что не характерно для иммунного ответа человека. В некоторых случаях положительным контролем может служить использование антиидиотипической антисыворотки или МкАТ. Необходимо подобрать правильные отрицательные контроли. В целях подтверждения специфичности подтверждающих методов количественного определения возможно использование проб, содержащих нерелевантные МкАТ.
5. Оценка нейтрализующей способности антител, индуцированных лекарственным препаратом моноклональных антител
Свое действие МкАТ оказывают с помощью различных механизмов, начиная от простого связывания с антигеном, которое само по себе опосредует клинический эффект, до связывания с антигеном и опосредуя 1 или несколько иммунобиологических механизмов, которые совместно определяют совокупный клинический ответ. Следовательно, несмотря на то, что может показаться, что простое связывание является единственным механизмом, определяющим клиническую эффективность, свой вклад могут вносить также и другие эффекты. В некоторых случаях множественные функции МкАТ действуют аддитивно или синергично, приводя к совокупному комбинированному клиническому эффекту, что в некоторых случаях поддается трудной экспериментальной дифференциации, позволяющей установить, каким образом МкАТ оказывает свое клиническое действие.
В связи с этим при использовании интактных МкАТ необходимо с осторожностью выдвигать предположение о том, что Fc-опосредованные иммунобиологические эффекты препарата не вносят вклад в клиническую эффективность, даже если простое связывание с антигеном рассматривается в качестве основного механизма действия. В этой связи преимуществом для определения нейтрализации обладает количественное определение на основе клеток. В таких случаях, используя биологические и иммунологические методы количественного определения, необходимо провести тщательное установление биологических характеристик МкАТ. Затем необходимо оценить свойства МкАТ, чтобы подобрать надлежащую стратегию количественного определения нейтрализации. Антитела, нейтрализующие биологическую активность биологических препаратов, способны снижать их клиническую эффективность. Необходимо определять нейтрализующую способность всех выработанных антител. Отсутствие таких данных требует обоснования.
В отношении большинства биологических препаратов наиболее подходящим методом количественного определения нейтрализующей способности антител является количественный биологический метод, определяющий нейтрализацию антителами биологической активности препарата. Вместе с тем характер клинического способа действия МкАТ предполагает, что наиболее выражено снижают клиническую эффективность выработанные антитела, блокирующие связывание МкАТ с мишенью.
Таким образом, методами выбора с целью определения нейтрализующей способности МкАТ являются конкурентные методы связывания с лигандом, а не классические количественные биологические методы. Это отличает МкАТ с точки зрения оценки иммуногенности от других классов биологических препаратов.
6. Управление рисками иммуногенности препаратов моноклональных антител
6.1. Идентификация рисков Иммуногенность
МкАТ является сложным явлением: имеется ряд трудно понимаемых факторов, которые затрудняют точное прогнозирование клинически значимого иммунного ответа на терапевтическое или диагностическое моноклональное антитело. Разработаны in vitro доклинические подходы, нацеленные на обнаружение образованных T-клеточных эпитопов, однако они обладают ограниченной способностью прогнозировать иммуногенность препарата у человека. Вместе с тем такие методики могут пригодиться при выборе молекул-кандидатов для дальнейшей разработки. Как указано в главе 11 настоящих Правил, необходимо изучить стандартные аспекты иммуногенности каждого нового МкАТ для медицинского применения, учитывая его свойства, характер предлагаемого применения и показание к применению. В основе планирования будущих исследований лежат предварительные данные об иммуногенности, полученные по результатам ранних клинических исследований, например, изучение функциональных характеристик биоаналитических методик, обнаружение предсуществующих антител или иные факторы, которые могут исказить обнаружение антител к МкАТ, вызванных его применением.
Основываясь на стратегии идентификации и оценки рисков, описанной ниже, стандартную программу изучения иммуногенности в зависимости от уровня идентифицированных рисков допускается сократить (с детальным обоснованием) либо может потребоваться усиление такой программы. Во всех случаях заявитель должен провести тщательную идентификацию рисков, учитывающую свойства препарата и его предлагаемое применение. Предварительные данные Необходимо учитывать имеющиеся данные или их отсутствие о прочих аналогичных МкАТ (например, связывающихся с тем же классом мишеней, экспрессирующихся теми же экспрессирующими системами). Если методология обнаружения антител к МкАТ или выявления клинических последствий (например, остаточная концентрация МкАТ, ФД-параметры и эффект от терапии МкАТ) антител к МкАТ недостаточно чувствительна, то восприятие риска может быть завышено.
В таких случаях целесообразно осуществлять более тщательное наблюдение за динамикой анти-МкАТ ответа, соотнося его с терапевтическими исходами. Структура МкАТ Антитела могут вырабатываться к различным эпитопам, представляющим собой разные части молекулы МкАТ, например, вариабельным или константным участкам.
Распознавание гетерологичных (например, последовательностей грызунов или химерных МкАТ) антител в качестве чужеродных служит основной причиной антитело-опосредованного иммунитета, а собственные антитела могут вырабатываться к любой их части. В случае гуманизированных или полностью человеческих последовательностей МкАТ, имеющих аминокислотные последовательности только иммуноглобулина человека, иммунный ответ проявляется формированием, в основном, антиидиотипических антител, специфичных к гипервариабельной последовательности регионов и определяющих комплементарность связывания с антигеном, которые, с большой долей вероятности, могут приводить к снижению клинической эффективности и ответа на терапию МкАТ. Вместе с тем в некоторых случаях антитела могут вырабатываться к константному участку человеческих и гуманизированных МкАТ, что может влиять на их эффекторные функции и сказываться на клинической эффективности МкАТ.
Клинический опыт применения новых конструкций, основанных на МкАТ, ограничен, что также может повышать восприятие риска. Необходимо уделять особое внимание препаратам следующих поколений, например, биспецифичным МкАТ и МкАТ-фрагментам, а также их способности оголять скрытые антигенные детерминанты. Измененные профили гликозилирования могут снижать или повышать иммуногенные свойства молекулы (например, изменение экранирования белкового остова). Нетипичные профили гликозилирования, например, встречающиеся в начале использования новых экспрессирующих систем, могут представлять повышенный риск иммуногенности по сравнению с широко используемыми экспрессирующими системами.
К другим факторам, влияющим на иммуногенность, относятся производственные примеси и прочие показатели качества. Следовательно, могут потребоваться более глубокие аналитические и клинические подходы, направленные на оценку, установление характеристик и возможное ослабление таких потенциальных рисков, необходимо должным образом идентифицировать риски, обусловленные качеством препарата. Например, МкАТ к мишени, в отношении которой накоплен значительный опыт, но которое производится с помощью новой экспрессирующей системы, может иметь менее воспринимаемый риск с точки зрения его механизма действия, но повышенный риск с точки зрения потенциального влияния примесей вследствие недостаточности сведений об их безопасности.
Механизм действия.
Необходимо должным образом установить характеристики и всесторонне изучить механизм действия МкАТ (например, цитолитический, апоптотический) и, особенно, свойства молекулы- мишени (например, угнетение или стимуляция иммунитета). Антитела к МкАТ, мишенью которых является идиотип МкАТ, как правило, снижают эффективность. Необходимо аналогичным образом тщательно изучить влияние антител к МкАТ, распознающих аллотипические или другие участки, поскольку образование иммунных комплексов может привести к нежелательным реакциям у реципиента. Непрямые эффекты антител, выработанные в ответ на МкАТ, также могут представлять важность, например, МкАТ, мишенью которых являются молекулы, вовлеченные в сигнальные каскады, могут индуцировать антитела, перекрестно связывающиеся с молекулами- мишенями, действуя в качестве агониста, что может привести к повышенной активации иммунной системы и, возможно, вылиться в синдромы высвобождения цитокинов. На уровне отдельного пациента такое достаточно сложно спрогнозировать. В отношении МкАТ- агонистов и МкАТ, перекрестное связывание которых может привести к активации иммунитета, заявители должны предусмотреть тщательное наблюдение за пациентами в ходе ранних клинических исследований на предмет таких явлений.
Клинические факторы.
Значительное влияние на иммуногенность оказывают клинические факторы. Иммуногенность к МкАТ может зависеть от возраста, например, метаболизм белков у детей и взрослых различается, что может привести к различиям в иммуногенности, к примеру, антитела, применяемые при ювенильном артрите по сравнению с ревматоидным артритом в сопоставимых дозах. Введение аналогичных (подобных) или родственных антител в анамнезе также может повлиять на иммуногенность. Лекарственные препараты МкАТ, используемые с прерывистой (интермиттирующей) схемой введения (например, с различными интервалами между введениями препарата), могут иметь более высокую вероятность проявления иммуногенности, чем при использовании препаратов в режиме регулярного введения или по цикличным схемам. Наличие у антител к МкАТ клинически значимых эффектов определяется участком связывания антитела, его аффинностью к МкАТ, а также его титром.
Антитела к МкАТ могут быть преходящими и исчезать в ходе лечения или, наоборот, персистировать на протяжении всего лечения и даже дольше. Выработка антител к одним МкАТ не приводит к каким-либо значимым клиническим последствиям, тогда как их выработка к другим может проявляться снижением эффективности или обусловленными лечением нежелательными явлениями.
6.2. Оценка риска
В формирование иммунного ответа на МкАТ вносят вклад множество факторов, требующих учета в ходе оценки рисков. Факторы, влияющие на частоту и тяжесть иммунного ответа на МкАТ (факторы риска, зависящие от препарата, процесса производства и специфики заболевания и (или) пациентов), могут быть положены в основу подхода, согласно которому эти факторы риска характеризуют с позиции доступности и выполнимости их минимизации в стратегиях оценки (или идентификации) риска.
Идентификация рисков, основанная на обсуждаемых выше факторах, ведет к оценке, объединяющей отдельные клинические риски и надлежащим образом спланированную программу изучения иммуногенности, являющуюся частью клинической разработки. Оценка рисков требует междисциплинарного подхода, учитывающего все выявленные риски, например, обусловленные стратегией контроля качества препарата, включая состав препарата, обоснование пределов приемлемости по родственным вариантам и родственным примесям. Это также подразумевает, что если на различных этапах разработки препарата происходит изменение МкАТ, оценка совокупных рисков должна проводиться при каждом исследовании сопоставимости, проводимом в ходе разработки.
Таким образом, основной стороной оценки рисков является анализ частоты возникновения и клинические последствия нежелательного иммунного ответа, а также возможность предотвращения таких последствий, их правильного определения и (или) медицинской коррекции. В зависимости от выявленных рисков и доступных мер наблюдения и снижения таких рисков, программа изучения иммуногенности может быть меньшей или превосходить ту, что описана в главе 11 настоящих Правил. Заявители должны обосновать и проанализировать принятый подход. В зависимости от класса и подкласса МкАТ (влияющих на иммунобиологические функции, например, связывание с Fc- рецепторами) или механизма действия, клинические последствия, обусловленные нежелательным иммунным ответом на отдельные препараты МкАТ, могут различаться. Например, МкАТ могут подвергаться нейтрализации антителами, приводящей к снижению эффективности, или вызывать нежелательные явления, например, инфузионные реакции и (или) образование иммунных комплексов. Такие инфузионные реакции могут быть тяжелыми, но их (не являющихся аллергическими реакциями гиперчувствительности) можно снизить с помощью надлежащих клинических мер, например, премедикации. При снижении эффективности наличие других МкАТ или родственных терапевтических белков, являющихся альтернативным методом лечения, также может служить важным фактором стратегии снижения рисков.
Общий принцип: при подаче заявлении о регистрации необходимо представить достаточные данные, позволяющие оценить тяжесть, частоту возникновения и идентифицируемость рисков. Затем (при необходимости) такие риски могут быть подвергнуты более глубокому изучению с помощью пострегистрационных исследований и наблюдения.
В качестве отправной точки при оценке и снижении рисков определенную ценность могут представлять следующие факторы:
- стратификация рисков, основанная на принципах их выявления, описанная в предыдущем разделе, совмещенная с факторами, обусловленными препаратом, например, выявление внутренних иммуногенных последовательностей, физико-химический профиль, включая агрегаты и прочие родственные и производственные варианты, сведения о разработке состава, например, растворимость при физиологических pH, расположение антигена-мишени и др.;
- сведения о функциональных характеристиках метода количественного определения, описанные в настоящей главе, особенно, в какой степени снижается селективность выбранного формата количественного определения МкАТ вследствие остаточной циркуляции препарата;
- при неизбежном несовершенстве метода количественного определения: наличие мер, позволяющих дополнить контроль за антителами к МкАТ, например, определение ФД- или ФК-параметров; наличие методов количественного определения, позволяющих обнаружить ранний иммунный ответ (например, раннее определение связывающих МкАТ, определение IgM для обнаружения раннего иммунного ответа);
- восприимчивость популяции пациентов, терапевтический индекс, аутоиммунный статус, одновременное применение иммунодепрессантов и др.;
- по сравнению с другими клиническими областями, снижение эффектов в онкологической практике сложнее поддается обнаружению, поскольку прогрессирование опухоли сложно соотнести с выработкой антител.
Прогрессирование заболевания и, как следствие, снижение ответа на терапию через некоторое время наблюдается, как правило, почти у всех пациентов, что может затруднить отличие от эффектов, опосредованных иммуногенностью. Вследствие чего, в ходе клинических исследований может потребоваться более интенсивное изучение, чтобы определить, чего ожидать в пострегистрационных условиях, особенно при наличии альтернативных методов лечения; введение МкАТ на дому и в стационаре: преимуществами введения МкАТ в стационаре является немедленное купирование инфузионных реакций и анафилаксии (при возникновении таковых), однако подкожное введение МкАТ на дому более удобно пациенту.
Таким образом, заявителю необходимо сопоставить риск нежелательного иммунного ответа и его последствий с предлагаемым клиническим применением. Например, МкАТ с повышенной частотой реакций после их подкожного введения в меньшей степени подходят для введения на дому; доступность альтернативных методов терапии или диагностических процедур в случае снижения эффективности или возникновения инфузионных реакций или анафилаксии.
6.3. Мониторинг и снижение рисков
Следуя такому подходу выявления и оценки рисков, заявители должны тщательно спланировать эту концепцию на раннем этапе разработки препарата, затем, по мере получения новых данных, регулярно пересматривать и обновлять ее в ходе процесса разработки и на протяжении всего жизненного цикла препарата. В начале клинической разработки заявители, если того требуют другие факторы, вправе, к примеру, присвоить повышенный риск МкАТ, несмотря на то, что механизм действия per se необязательно предполагает наличие повышенного риска. По результатам крупных клинических исследований может потребоваться пересмотреть величину риска. В ходе регистрации заявители должны тщательно обосновать и проанализировать совокупную концепцию плана и объема исследований иммуногенности, проведенных в ходе программы разработки. Если в отношении лекарственных препаратов указываются, что они обладают благоприятным иммуногенным потенциалом (например, указание в общей характеристике лекарственного препарата), необходимо представить дополнительные данные, обосновывающие такое указание.
В зависимости от результатов оценки рисков в некоторых случаях в ходе клинической разработки могут потребоваться более тщательные и глубокие исследования. Например, если МкАТ содержит нечеловеческие углеводные структуры, такие как галактозо-α-1,3-галактоза, в целях недопущения тяжелой анафилаксии до введения препарата пациентам в некоторых случаях необходимо провести анализ на IgE. Другим примером необходимости анализа на IgE является высокая частота аллергических реакций на первое введение препарата в ходе ранней клинической разработки препарата. Несмотря на то, что определение содержания подклассов IgG или иных классов Ig, например, IgA, как правило, не является стандартным требованием изучения иммуногенности МкАТ, такие исследования могут потребоваться, если будут обнаружены определенные риски (например, назальное введение). При этом для установления нейтрализующей способности и преходящего (персистирующего) характера МкАТ, как правило, требуется многократное взятие образцов.
В зависимости от степени выявленного относительного риска, частота и сроки отбора проб и их анализ могут варьировать. На поздних этапах разработки допускается снизить частоту отбора проб МкАТ с меньшим риском при условии того, что нежелательные явления или снижение эффективности не отмечались. Тем не менее на протяжении всей программы разработки необходимо на стандартной основе предусмотреть ведение банка проб.
Для препаратов МкАТ, риск применения которых более высокий, отбор проб может быть более частым в течение всего периода клинических исследований. В этом случае рекомендуется анализировать пробы в реальном времени. В ходе клинической разработки может потребоваться одновременное, а также в течение периода регулярного введения, определение содержания антител, ФК-, ФД-маркеров, эффективности, безопасности. Это позволяет оценить клиническую значимость выработки антител, а также изменение их эффекта во времени, которое может быть обусловлено повышением их титра и (или) изменением изотипа/созреванием аффинности антител. Антимоноклональные антитела, не обладающие нейтрализующей способностью, могут косвенно влиять на эффективность, связываясь с препаратом МкАТ или изменяя его фармакокинетические свойства. Именно поэтому определение ФК-параметров может содействовать планированию способов определения антимоноклональных антител.
В целях управления рисками можно использовать результаты количественного определения. Например, если согласно заключению выявления и оценки рисков необходимо раннее выявление иммунного ответа и допускается возможность отмены терапии МкАТ, выработка низкоаффинных IgM может служить индикатором раннего иммунного ответа, а определение IgM может способствовать раннему выявлению пациентов, у которых развивается иммунный ответ. Аналогично, обнаружение связывающих антител, не обладающих нейтрализующей способностью, может служить ранним предвестником последующего образования нейтрализующих антител.
Стратегии ослабления рисков могут, к примеру, включать изучение способов ведения пациентов, у которых обнаружен иммунный ответ, например, возможность учащения введения препарата без угрозы его безопасности и др. Однако необходимо учитывать выполнимость таких действий. При подаче регистрационного досье заявителям рекомендуется представлять объединенную обобщенную стратегию идентификации, описания, мониторинга, минимизации и снижения рисков. Такой основанный на рисках подход должен также учитывать план управления рисками, в котором анализируются способы идентификации рисков по данным из программы разработки, и потенциальные риски, а также отсутствующие сведения, которые необходимо получить на пострегистрационном этапе.
Сегодня они стали необходимым реагентом в биологических лабораториях. Продажи препаратов, в которых встречаются моноклональные антитела, направленные на терапию тяжелейших заболеваний (псориаз, рак, артрит, склероз), имеют многомиллиардный оборот. Хотя в 1975 году, когда была опубликована статья про метод получения гибридом, лишь единицы поверили в их практическое применение.
Что такое моноклональные антитела
Они вырабатываются иммунными клетками, происходящими от одной предшественницы, принадлежащими к одному клону. Это явление наблюдается при выращивании В-лимфоцитов в культуре. Такие антитела могут вырабатываться против почти любого природного антигена (к примеру, бороться с чужеродным белком и полисахаридами), который они будут специфически связывать. Далее они используются для обнаружения этого вещества или его очистки. Моноклоны широко применяются в биохимии, молекулярной биологии, медицине. Производить антитела нелегко, что напрямую влияет на их стоимость.
Получение моноклональных антител
Этот процесс начинается с иммунизации животных, как правило, мышей. Для этого вводят специфический антиген, который синтезирует антитела против него. Затем у мыши удаляется селезенка и гомогенизируется для получения суспензии клеток. Она содержит B-клетки, продуцирующее антитело. Затем их смешивают с миеломой (мышиной плазмоцитомы), которая имеет непрерывную способность синтезировать себе подобных в культуре (опухолевые клоны).
Благодаря слиянию образуются гибриды опухолевых и нормальных клеток (гибридомы), непрерывно растущие и способные производить смесь антител заданной специфичности. Следующий шаг после получения гибридом - клонирование и отбор. В каждую лунку специального планшета помещают около 10 слитых клеток и культивируют их, проверяя на выработку специфических иммуноглобулинов. Гибридомы из лунок, содержащих нужные идентичные антитела (парапротеины), клонируют и вновь проверяют. Так делают 1-2 раза.
В результате получают клетки, способные производить собственные иммуноглобулины только одной нужной уникальной специфичности. Далее клоны можно заморозить и сохранять. Или же культивировать, накапливать, привить мышам, где они также будут расти. Впоследствии полученные молекулы иммуноглобулина разными методами очищаются от посторонних примесей и используются для диагностики в лабораториях или терапевтического применения.
Важно отметить, что полученный с помощью гибридомы клеточный клон является мышиным иммуноглобулином, который при попадании в организм человека вызовет реакцию отторжения. Выход нашли благодаря рекомбинантным технологиям. Взяв фрагмент мышиного моноклона, соединили его с фрагментом человеческого иммуноглобулина. В результате были получены гибридомы, получившие название химерных, которые были уже более близкими для человека, но все равно провоцировали иммунные реакции организма, отличающиеся от требуемых.
Следующий шаг был сделан благодаря генной инженерии и связан с созданием, так называемых гуманизированных антител, на 90% гомологичных человеческому иммуноглобулину. От первоначального гибридомного мышиного моноклона осталась лишь маленькая часть от слияния клеток, которые отвечают за специфическое связывание. Они и используются в клинических испытаниях.
Применение
Моноклоны успешно вытесняют иммунные сыворотки. Гибридомы создали удивительные возможности в аналитике: их применяют как «микроскоп» с необычайно высоким разрешением. С их помощью можно обнаружить уникальные антигены, характерные для раковых клеток конкретных тканей, получить к ним моноклоны определенной специфичности и использовать для диагностики и типирования новообразований. Применяют их еще при лечении псориаза, рассеянного склероза, артритов, болезни Крона, раке молочной железы и многих других.
При псориазе
Для терапии псориаза тяжелых форм назначают прием системных глюкокортикостероидов (стероидные гормоны), влияющих на гормональный фон человека и подавляющих местный иммунитет. Моноклональные антитела при псориазе воздействуют исключительно на активные клетки псориатического воспаления, не подавляя иммунную систему полностью. Терапевтический эффект – снижение активности воспаления, нормализация деления клеток кожи и исчезновение псориазных бляшек.
При ревматоидном артрите
Моноклональные антитела при ревматоидном артрите оказались эффективны в тех ситуациях, где другие средства не оказали лечебного действия. В европейских странах сегодня основным терапевтическим направлением при этом недуге являются такие препараты. Терапевтический курс длительный по времени, ведь лекарства действуют хоть и эффективно, но медленно. Из-за сложностей в диагностике артритов за лечебной помощью стоит обращаться как можно раньше, при первых же симптомах и подозрениях.
Для лечения рака
Для большого числа пациентов с онкологией фармпрепараты, в составе которых содержатся моноклоны, стали надеждой на выздоровление и возврат к нормальной жизни. Многие люди с крупными злокачественными опухолями тела, множеством опухолевых клеток и малоутешительными прогнозами после курса терапии почувствовала улучшение состояния. Моноклональные антитела для лечения рака имеют очевидные преимущества:
- Прикрепляясь к злокачественным клеткам, они не только делают их более заметными, но и ослабляют, нарушают их структуру. С ними человеческому организму бороться гораздо легче.
- Обнаружив свою цель, они способствуют блокировке рецепторов роста опухоли.
- Разработка антитела осуществляется в условиях лабораторий, где они намеренно соединяются с малым количеством радиоактивных частиц. Перенося эти частицы по организму, они доставляют их прямо к опухоли, где те и начинают действовать.
Принцип лечения
Действие моноклонов простое: они распознают определенные антигены и связываются с ними. Благодаря этому иммунная система быстро замечает проблему и вступает с ней в борьбу. Они помогают организму человека самостоятельно справиться с антигенами. Еще одно их огромное преимущество – воздействие исключительно на патологически измененные клетки, не нанося при этом вреда здоровым.
Препараты с моноклональными антителами
Хотя изобретены гибриды нормальных и опухолевых клеток такого типа были не очень давно, спектр препаратов, содержащих их в своем составе, уже выглядит внушительно. Новинки фармацевтики появляются регулярно. Такие препараты, как и большинство лекарственных средств, имеют различные побочные эффекты. Нередко после применения моноклональных веществ поступают жалобы на проявление аллергических реакций в виде зуда, сыпи. Изредка терапия сопровождается тошнотой, рвотой или кишечным расстройством. Далее об эффективных препаратах подробнее.
Стелара
Используется при терапии тяжелых форм бляшечного псориаза. Фармпрепарат состоит из моноклонов человека, что сводит риск возникновения побочных эффектов к минимуму. Форма выпуска – раствор для подкожного введения во флаконе или в шприце. Рекомендованная дозировка составляет 45 мг в сутки. Вторую инъекцию вводят через 4 недели после первой, далее уколы делают 1 раз в 12 недель. Терапевтический эффект от Стелара проявится уже через 15-20 дней. Поддерживающее лечение обеспечивает продолжительность ремиссии. После 2 инъекций кожа очищается на 75%.
Ремикейд
Представляет собой химерные антитела на основе моноклонов мыши и человека. Препарат снижает воспаление эпидермиса, регулирует деление кожных клеток. Форма выпуска – порошок лиофилизированный для приготовления парентерального раствора или во флаконах 20 мл. Состав для инфузий вводят внутривенно на протяжении 2-х часов со скоростью до 2 мл в минуту. Дозировка зависит от степени тяжести болезни. Повторные инъекции делают через 2 и 6 недель после первой. Для поддержки эффекта терапию повторяют каждые 1,5-2 месяца.
Хумира
Рекомбинантный моноклон с пептидной последовательностью, идентичной человеческой. Препарат эффективен при терапии сложных форм псориаза, тяжелом активном ревматоидном и псориатическом артрите. Применяется в виде подкожных инъекций в область живота или переднюю бедренную поверхность. Форма выпуска – раствор для подкожного введения. Уколы по 40 мг вводятся 1 раз в 2 недели.
Моноклональные антитела (МАТ) – это антитела, произведенные в лабораторных условиях, которые имеют способность связываться с конкретными антигенами раковых клеток.
Например, белок, присутствующий на поверхности клеток рака, в здоровых клетках он не наблюдается или находится в минимальном количестве.
Система разработки моноклональных антител
Для создания моноклональных антител экспериментаторы вводят их грызунам с антигеном из человеческих раковых клеток. После этого они берут клетки, производящие антитела от животных и индивидуально соединяют их с раковой миеломной клеткой. Таким образом, получаются слитые клетки, известные под названием гибридомы.
Каждая отдельная гибридома (клеточная линия) путем деления далее производит дочерние идентичные клетки или клоны, которые и получили название «моноклональные».
Антитела, выдаваемые различными клонами, проходят проверку на способность идентифицировать такие антитела, которые намного теснее связаны с антигеном. При помощи этих гибридных бессмертных клеток можно получить большие количества антител.
Ввиду того, что мышиные антитела способны самостоятельно вызывать у людей иммунный ответ, который может снизить их эффективность, антитела мышей зачастую «очеловечивают» методом замены большей части родного антитела (человеческими порциями, насколько это возможно). Этот путь проделывается при помощи генной инженерии.
Механизм действия
Каждая группа моноклональных антител работает по-своему. Некоторые препараты стимулируют иммунный ответ, разрушающий раковые клетки. Эти моноклональные антитела, равно как и антитела, полученные физиологическим путем работы В-клеток, покрывают поверхность раковой клетки оболочкой, тем самым вызывая разрушение ее иммунной системой.
Медициной уже одобрены моноклональные антитела этого типа. Например, ритуксимаб – препарат ориентирован на антиген CD20, обнаруженный в клетках неходжкинской лимфомы, или алемтузумаб, ориентированный на антиген CD52, который был найден в клетках ХЛЛ (хронического лимфолейкоза).
Ритуксимаб способен непосредственно являться причиной гибели клеток (апоптоз). Другая группа препаратов моноклональных антител, связываясь с рецепторами находящимися на поверхности клеток иммунной системы, стимулирует противоопухолевый иммунный ответ и уменьшает сигналы, мешающие иммунным клеткам нападать на ткани собственного организма, в число которых входят и раковые клетки.
Ипилимумаб, относящийся к группе подобных препаратов, был создан сравнительно недавно в 2011 году для лечения метастатической меланомы. Существуют и другие аналогичные лекарства, но они еще находятся в стадии клинических исследований.
Антитела мешают деятельности белков (VEGF), необходимых для роста раковой опухоли. Например, действие препарата бевацизумаб направлено на эндотелиальный сосудистый фактор роста белка, выделяемого опухолевыми и другими клетками, находящимися в микроокружении опухоли (это способствует разветвлению кровеносных сосудов, питающих злокачественную опухоль).
В тот момент, когда бевацизумаб связывается с VEGF, белок теряет способность взаимодействовать с клеточными рецепторами, что предотвращает рост новых кровеносных сосудов.
По такой же аналогии действуют препараты панитумумаб и цетуксимаб. В данном случае целевым выступает EGFR (рецептор эпидермального фактора и роста), а моноклональные антитела трастузумаб настроены на HER-2 (человеческий рецептор эпидермального фактора роста 2).
МАТ, связывающиеся с клеточной основой фактора роста рецепторов, мешают рецептору отправлять свои нормальные, вызывающие рост, сигналы. Кроме того они могут активизировать иммунную систему и запускать апоптоз для уничтожения опухолевых клеток.
К другой группе противоопухолевых терапевтических моноклональных антител относятся иммуноконъюгаты. Их иногда называют антитела конъюгаты или иммунотоксины – эти препараты объединяют в своем составе:
- химиотерапевтические препараты;
- бактериальные токсины;
- радиоактивные молекулы, прикрепленные к веществу клеток киллеров.
Прикрепляется антитело на поверхности раковой клетки к своему специфическому антигену, и в ту же минуту действующее вещество начинает растворять раковые клетки. Работающие таким образом и утвержденные иммуноконъюгаты – это, прежде всего:
- ибритумомаб тиуксетан, действие которого направлено на антиген CD20. Препарат ориентирован на доставку радиоактивного иттрия-90 к В-клеткам, что необходимо для устранения неходжкинской лимфомы;
- шума-трастузумаб эмтансин, ориентированный на молекулу HER-2. МАТ нужен для доставки препарата DM1, ингибитора пролиферации клеток. HER-2 относится к метастатическим клеткам онкологии молочной железы;
- тозитумомаб, ориентированный на антиген CD20 для доставки радиоактивного йода-131 к клеткам неходжкинской лимфомы.
Сфера применения и стоимость
Цена на моноклональные антитела по мере роста их производства будет уменьшаться. Все описанное выше довольно сложно. Однако наука не стоит на месте, а высокими темпами движется вперед. Поэтому сегодня моноклональные антитела являются эффективным средством для борьбы с раком и находят широкое применение в других направлениях медицины.
Ввиду важности исследований, проведенных для создания моноклональных препаратов, в работу были вовлечены ведущие фармацевтические компании всего мира. Сегодня МАТ – основное направление разработок по борьбе с раком.
Вполне естественно, что цена на препараты сегодня далека для массового использования. Но в перспективе планируется уменьшение себестоимости МАТ, что значительно скажется на понижении цены в розничной торговле. Например, с препаратом ипилимумаб это уже произошло.
Препарат Ипилимумаб (его аптечное название Ервой - Yervoy) создан для лечения прогрессирующих стадий рака щитовидной железы, простаты, кожи и некоторых других видов раковых опухолей. Несмотря на то, что на рынке препарат появился совсем недавно (2011 г.), он успел себя проявить как результативное средство в борьбе с поздними стадиями меланомы.
Использование препарата (по данным статистики) позволило сократить смертность среди пациентов на 50%. Следует отметить, что меланома в прогрессирующей стадии ранее не поддавалась лечению. Не удивительно, что сегодня стоимость препарата еще очень далека от возможности широкого применения:
- Ипилимумаб 5мг/мл – 1 упаковка 10 мл, стоимость вместе с доставкой из Германии в Москву – 4650 €.
- Ипилимумаб 5мг/мл – 1 упаковка 40 мл, стоимость вместе с доставкой из Германии в Москву – 17 500 €.
Поставщик гарантирует своевременную доставку и подтверждение покупки в аптеке Германии всеми документами и сертификатами.
Препарат Бевацизумаб (действующее вещество бевацизумаб, аптечное название Авастин) – раствор для инъекций от 17000 руб. за 25 мл. МАТ обладает довольно узкой направленностью – метастатический колоректальный рак. Нередко лекарство назначают в комплексе с химиотерапией, основанной на агенте фторпиримидина и его производных.
Важно! Авастин хорошо проявил себя в офтальмологии. Препарат широко использует Московская Глазная Клиника. Ввиду того, что моноклональные антитела успешно применяются для лечения такого «тонкого аппарата» как глаз, результатам клинических испытаний вполне можно доверять и назначатьМАТ для избавления от онкологии.
Конечно, для офтальмологических целей препараты готовят с некоторым отличием, поэтому и стоимость глазного Авастина будет другой, чем цена концентрата для инфузивного использовании при лечении онкологических заболеваний.
Препарат моноклональных антител Цетуксимаб (другое название Эрбитукс, действующий компонент цетуксимаб). Стоимость упаковки (5 мг/мл) от 8500 руб. Направленность – злокачественные опухоли головного мозга, лица и шеи. К этим заболеваниям можно добавить рак толстого кишечника и онкологии, имеющие другую локализацию, но непременно вторичный рак.
Применение МАТ при ревматоидном артрите
Среди пациентов страдающих ревматоидным артритом данная методика лечения нашла широкое применение. Моноклональные антитела весьма эффективны в тех случаях, где другие препараты не оказали терапевтического действия.
В странах Европы на сегодняшний день основным терапевтическим направлением при ревматоидном артрите являются именно моноклональные антитела. В этом плане используется Метотрексат. Если состояние пациента не улучшается, назначают моноклональные препараты с направленностью к В-лимфоцитам.
Терапевтический курс при артрите довольно длительный, так как моноклональные антитела действуют достаточно медленно.
Принимается во внимание и тот факт, что диагностировать ревматоидный артрит очень сложно. Сегодня ни один биохимический или тест не может дать абсолютно точного результата, указывающего на присутствие у пациента именно ревматоидного артрита, а не другого схожего заболевания.
Поэтому к ревматологу за помощью следует обращаться как можно раньше, при первых симптомах и подозрениях на артрит.
Над созданием моноклональных препаратов трудились ученые многих стран. Действие этих лекарств невозможно сопоставить с другими медицинскими препаратами от ревматоидного артрита, существующими на сегодняшний день.
Их первостепенная задача – определение конкретного антигена. Все моноклональные лекарства принадлежат к иммуноглобулиновому классу. Они точно выявляют антитела и вызывают на себя иммунную реакцию. Для совершенствования методик лечения ревматоидного артрита фармакологи всего мира постоянно проводят в этой области научные исследования.
Лекарственная иммунная гемолитическая анемия составляет около 20% от всех приобретенных иммунных гемолитических анемий .При большинстве других лекарственных иммунных гемолитических анемий антитела направлены против комплекса лекарственное средство-мембранный гликопротеид. Гемолиз наблюдается только во время приема препарата и обычно быстро прекращается после его отмены.
Образование иммунных комплексов. Иммунные комплексы, состоящие из лекарственного средства и антитела, неспецифически связываются с мембранами эритроцитов с последующей активацией комплемента. Прямая проба Кумбса с антителами к комплементу обычно положительна, а с антителами к IgG - отрицательна. Антитела к препарату можно обнаружить с помощью инкубации сыворотки больного с нормальными эритроцитами в присутствии комплемента и данного препарата. Большинство случаев лекарственной иммунной гемолитической анемии обусловлены именно этим механизмом ( табл.16.3). Повторное назначение препарата даже в небольшой дозе вызывает острый внутрисосудистый гемолиз , проявляющийся гемоглобинемией , гемоглобинурией , острой почечной недостаточностью .
При гемолизе, вызванном аутоантителами, выздоровление более медленное (обычно несколько недель). Проба Кумбса может оставаться положительной в течение 1-2 лет.
Лекарственные средства, вызывающие иммунную гемолитическую анемию, в зависимости от механизма действия делят на две группы.
К первой относятся
